用于靶向免疫療法的化合物的制作方法
用于靶向免疫療法的化合物
1.本技術是申請日為2013年7月16日、申請號為201380033552.6、名稱為“用于靶向免疫療法的化合物”的專利申請的分案申請。
2.相關申請的交叉引用
3.本技術要求2012年7月18日提交的中國專利申請第201210248481.9號的權益以及優先權，該中國專利申請的全部內容在此通過引用并入本文。
技術領域
4.本發明涉及用于靶向免疫療法的化合物以及含有該化合物的組合物。本發明還涉及所述化合物在諸如癌癥之類的疾病中的應用。
背景技術：
5.性抗體已用于臨床應用二十多年。目前已有十五種抗腫瘤抗體藥物用于臨床，這些藥物包括：rituxan(1997),herceptin(1998),mylotarg(2000),campath(2001),zevalin(2002),bexxer(2003),avastin(2004),erbitux(2004),vectibix(2006)；arzerra(2009)；benlysta(2011)；yervoy(2011)；adcetris(2011)；perjeta(2012)；和kadcyla(2013)。這些抗體主要靶定四種分子：egfr、her2、cd20和vegf。
6.總體而言，性抗體通過三種機制(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.(2012),12:278-87)殺傷腫瘤細胞：(1)抗體直接作用，也就是阻斷或激動配體/受體信號轉導活性，誘導細胞凋亡并遞送藥物或細胞毒素劑。抗體受體活化活性可產生直接殺傷腫瘤細胞的作用。例如，一些抗體可與腫瘤細胞表面的受體結合，活化受體，導致細胞凋亡(例如，在線粒體中)。抗體還可通過受體拮抗活性介導腫瘤細胞殺傷。例如，一些抗體可與細胞表面受體結合并阻斷二聚化作用、激酶活化以及下游信號轉導，從而抑制增殖并促進細胞凋亡。抗體與酶的結合可導致中和作用、信號阻斷以及細胞死亡。(2)免疫介導的細胞殺傷機制，該機制包括補體依賴性細胞毒性(cdc)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、t細胞功能調節，等等。免疫介導的腫瘤細胞殺傷可通過如下方式完成：誘導吞噬作用、活化補體、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性、通過單鏈可變片段(scfv)使基因修飾的t細胞靶定腫瘤，通過樹突細胞的抗體介導的抗原交叉呈遞活化t細胞、抑制t細胞抑制性受體(例如，細胞毒性t淋巴細胞相關抗原4(ctla4))。其中，抗體的fc部分的特性對于cdc和adcc介導的腫瘤細胞殺傷作用特別重要。(3)抗體對腫瘤脈管系統和基質的特異性效應，通過捕獲血管受體拮抗劑或配體誘導血管和基質細胞消融，包括：抑制基質細胞、將毒素遞送至基質細胞以及將毒素遞送至脈管系統(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.2012,12(4):278-87)。
7.性單克隆抗體藥物推進了抗癌藥物的研究和開發。然而，仍然存在一些問題需要進一步研究解決，例如，抗體的免疫原性、長期使用腫瘤靶標的耐受性以及單純地單一阻斷信號轉導通路的長期作用。簡言之，大多數抗體難以實現對腫瘤細胞長期有效的抑制和殺傷作用。
8.1964年，“自然(nature)”雜志發表了抗體-藥物偶聯(adc)技術這一新觀點，該觀點近年來得到突破性發展。adc使抗體與高毒物(毒素)通過化學連接體(連接體)共價連接。抗體識別癌細胞表面抗原分子，內吞作用將adc帶入細胞質內，具體而言，連接體水解之后釋放的細胞內環境毒素殺傷細胞。
9.seattle genetics已研發了brentuximab vedotin(商品名為adcetris)這種藥物，其已被fda批準上市。其為單甲基auristatin e(mmae)，一種合成的毒性抗癌藥物，其與靶向淋巴瘤細胞特異性cd30分子的抗體連接，具有改進的殺傷腫瘤細胞的效用。
10.目前，已對幾十種這樣的adc藥物開展了臨床試驗。其中，genentech和immunogen聯合開發了用于乳腺癌的與美登素(maytansine)偶聯的曲妥珠單抗，一種名為ado-曲妥珠單抗emtansine的藥物(kadcyla)，其也被稱為t-dm1。2013年2月，fda已批準t-dm1用于人表皮生長因子受體2(her2)-陽性轉移性乳腺癌。美登素為一種小分子毒素，其可與微管蛋白結合并可通過形成非還原性雙-馬來酰亞胺-丙二醇復合物防止微管形成。曲妥珠單抗通過靶向人her2對乳腺癌和胃癌起作用。曲妥珠單抗已被批準用于her2-陽性癌癥。然而，曲妥珠單抗無法促進所有的her2-陽性細胞的細胞凋亡。t-dm1使選擇性靶向her2受體的曲妥珠單抗與有效的細胞毒性劑美登素結合，從而殺傷腫瘤細胞。t-dm1抗體結合her2受體，導致從偶聯物中釋放的美登素產生細胞內在化作用，從而殺傷腫瘤細胞。t-dm1具有更好的整體療效、藥代動力學性質以及較低的毒性。
11.傳統的小分子化療藥物具有很強的毒性和藥代動力學優勢，但是在腫瘤的過程中傳統的小分子化療藥物可影響其他生理靶標，產生嚴重的副作用。抗體-藥物偶聯物使靶向作用和具有特定的藥代動力學的小分子藥物結合。抗體-藥物偶聯物的結構為具有靶向功能的單克隆抗體與具有特定的藥理學性質的化合物的連接。這種技術需要性抗體與靶標特異性結合，與諸如細胞毒素之類的具有作用或其他功能的分子偶聯。諸如偶聯的抗體的內吞作用、偶聯的穩定性以及毒素的釋放和殺傷活性之類的許多因素影響這種類型的抗體的作用。
12.目前正在使用的毒素分子包括微管蛋白抑制劑auristatin類似物單甲基auristatin e、單甲基auristatin f和美登素。單甲基auristatin e為合成的微管聚合物抑制劑，其可抑制微管聚集，干擾腫瘤細胞有絲分裂并且可誘導細胞凋亡(naumovski l and junutula jr.glembatumumab vedotin,a conjugate of an anti-glycoprotein non-metastatic melanoma protein b mab and monomethyl auristatin e for treatment of melanoma and breast cancer.curr opin mol ther2003；12(2):248-57.francisco ja,cerveny cg等人，cac10-vcmmae,an anti-cd30-monomethyl auristatin e conjugate with potent and selective antitumor activity.blood 102(4):1458-65)。單甲基auristatin f為抗有絲分裂auristatin衍生物，在c末端具有帶電荷的苯丙氨酸殘基。與不帶電荷的mmae相比，單甲基auristatin f最小化對細胞信號通路的破壞并且最小化細胞毒性。大量cd30細胞測試發現mab-馬來酰亞胺己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-p-氨基芐氧基羰基-mmaf(mab-l1-mmaf)的毒性比單獨的mmaf的毒性強2,200倍(doronina so等人,enhanced activity of monomethylauristatin f through monoclonal antibody delivery:effects of linker technology on efficacy and toxicity.bioconjug chem,2006；17(1):p114-24)。美登素為起到微管蛋白聚合的抑制劑
作用的抗有絲分裂劑，其干擾細胞核內的微管的形成。美登素還抑制dna、rna和蛋白質合成，已經發現美登素的最大影響是對與dna合成。
13.抗體-藥物偶聯物具有直接和間接抗癌作用。抗體阻斷或活化配體/受體信號轉導，誘導細胞凋亡，并且同時抗體可直接或間接地向腫瘤細胞呈遞或遞送有效載荷藥物(例如，藥物、毒素、小干擾rna或放射性同位素)。性抗體藥物偶聯物使用抗體和偶聯的藥物的雙重特性，第一為與靶標分子特異性結合的結合功能，第二為抗體自身的腫瘤細胞殺傷功能，以及第三為偶聯的藥物的特定作用。目前使用的抗體-藥物偶聯藥物限于如何直接殺傷腫瘤細胞。然而，由于在抗體、連接體分子、毒素分子、偶聯方面的嚴格的技術要求以及能夠帶入腫瘤微環境分子內的毒素有限，在實際的臨床研究中仍然存在一些難題。
技術實現要素：
14.一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
15.tm-ln-am
??
(i)，
16.其中，tm為靶向部分，am為能夠活化人免疫細胞的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數，所述人免疫細胞包括但不限于：樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、骨髓衍生的抑制細胞、nk細胞、b細胞、t細胞或腫瘤細胞或者它們的組合。
17.在一些實施方式中，人樹突細胞為漿細胞樣樹突細胞。在一些實施方式中，人樹突細胞為髓樣樹突細胞。
18.在一些實施方式中，am能夠特異性結合人toll樣受體7(tlr7)和/或人tlr8或者能夠通過tlr7和/或tlr8活化人免疫細胞。
19.另一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
20.tm-ln-am
??
(i)，
21.其中，tm為靶向部分，am為能夠特異性結合人tlr7和/或人tlr8或者能夠通過tlr7和/或tlr8活化人免疫細胞的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數。
22.在一些實施方式中，am能夠特異性結合人tlr7和人tlr8這兩者；或者能夠通過tlr7和/或tlr8活化人免疫細胞。
23.在一些實施方式中，當tm包括抗體時，am不包括cpg寡核苷酸。
24.在一些實施方式中，其中，所述靶向部分能夠特異性結合腫瘤細胞或者相對于非腫瘤細胞優先結合腫瘤細胞。在一些實施方式中，所述腫瘤細胞為癌細胞、肉瘤細胞、淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞或中樞神經系統癌癥細胞。
25.在一些實施方式中，所述靶向部分能夠特異性結合腫瘤抗原或者相對于非腫瘤抗原優先結合腫瘤抗原。在一些實施方式中，所述腫瘤抗原選自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。在一些實施方式中，所述腫瘤抗原選自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纖連蛋白,葉酸鹽受體,神經節苷酯gm3,gd2,糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整聯蛋白αν,整聯蛋白ανβ,kir,lag-3,lewisy,間皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘連蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配體蛋白
聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它們的變體。
26.在一些實施方式中，所述靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白質、肽、小分子、納米顆粒或核酸。
27.在一些實施方式中，所述靶向部分包含抗體或其功能片段。在一些實施方式中，所述抗體選自：美羅華(利妥昔單抗)、赫賽汀(曲妥珠單抗)、愛必妥(西妥昔單抗)、維克替比(帕尼單抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(貝利木單抗)、yervoy(伊匹單抗)、perjeta(帕妥珠單抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。
28.在一些實施方式中，所述靶向部分包含fab、fab’、f(ab’)2、單結構域抗體、t和abs二聚物、fv、scfv、dsfv、ds-scfv、fd、線性抗體、微抗體、雙體抗體、雙特異性抗體片段、bibody、tribody、sc-雙體抗體、κ(λ)body、bite、dvd-ig、sip、smip、dart或者含有一個或一個以上cdr的抗體類似物。
29.在一些實施方式中，所述靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反應蛋白-1模擬物、cdcrgdcfcg(環狀)多肽、sch 221153片段、ncngrc(環狀)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奧曲肽、伐普肽、蘭樂肽、c-3940多肽、達必佳、利普安、諾雷德或西曲瑞克。
30.在一些實施方式中，所述靶向部分包含葉酸或其衍生物。
31.在一些實施方式中，所述靶向部分包含細胞外結構域(ecd)或pd-1,ctla4,btla,kir,tim3,4-1bb,lag3的可溶形式、全長的部分表面配體雙調蛋白、β動物纖維素、egf、肝配蛋白、epigen、上皮調節蛋白、igf、神經調節蛋白、tgf、trail或vegf。
32.在一些實施方式中，所述靶向部分包含納米顆粒。
33.在一些實施方式中，所述靶向部分包含適體。
34.在一些實施方式中，所述活化部分包含：(a)單鏈rna(ssrna)，優選地為orn02、orn06、sspoly(u)、ssrna40、ssrna41、ssrna-dr或poly(dt)；或者(b)toll樣受體配體(tlrl)類似物，優選地為cl075、cl097、cl264、cl307、gardiquimod、洛索立賓、咪喹莫特或瑞喹莫德。
35.在一些實施方式中，所述連接體選自：肼基團，多肽，二硫化物基團和硫醚基團。
36.在一些實施方式中，所述連接體為酶可裂解的。在一些實施方式中，所述連接體不為酶可裂解的。
37.在一些實施方式中，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文提供的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或一種以上藥學上可接受的載體。
38.在一些實施方式中，所述藥物組合物還包含第二化療劑。在一些實施方式中，所述化療劑選自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),來曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,環磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他濱(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他賽(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),長春新堿,長春堿,噻氨酯噠唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他濱,埃博霉素,長春瑞濱(vinorelbine),喜樹堿,道諾霉素(daunorubicin),放線菌素d,米托蒽醌,吖啶,阿霉
素,表柔比星,或去甲氧基柔紅霉素。
39.另一方面，本發明提供一種用于需要這種的受治者體內的疾病病癥的方法，所述方法包括將藥物組合物給藥于所述受治者，所述藥物組合物包含有效量的本文提供的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
40.在一些實施方式中，所述疾病病癥為腫瘤。在一些實施方式中，所述疾病病癥包括異常細胞增殖。在一些實施方式中，所述異常細胞增殖包括癌前病變。在一些實施方式中，所述異常增殖的細胞為癌細胞。
41.在一些實施方式中，所述癌癥選自：乳腺癌、結腸直腸癌、彌漫性大b細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、濾泡性淋巴瘤、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、肺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和腎細胞癌。
42.又一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
43.tm-ln-am(i)，
44.其中，tm為靶向部分，am為活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數，條件是，當tm包含抗體時，am不包含cpg寡核苷酸或劑。
45.在一些實施方式中，所述活化部分包含tlr配體、nod樣受體配體、rig樣受體配體、clr配體、cds配體或炎性體誘導物。
46.在一些實施方式中，所述活化部分包含一種或一種以上選自以下的tlr(toll樣受體配體，tlrl)的配體：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9,和tlr10。
47.在一些實施方式中，所述活化部分包含：
48.(i)tlr2的配體，其選自：(a)熱殺死的細菌產物，優選地為hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)細胞壁成分產物，優選地為lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；
49.(ii)tlr3的配體，其選自：poly(i:c)和poly(a:u)；
50.(iii)tlr4的配體，其選自：lps和mpla；
51.(iv)tlr5的配體，其選自：fla和鞭毛蛋白；
52.(v)tlr7/8的配體，其選自：orn02,orn06,sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,poly(dt),cl075,cl097,cl264,cl307,gardiquimod,洛索立賓,咪喹莫特,和瑞喹莫德；
53.(vi)tlr9的配體，其選自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；
54.(vii)tlr10的配體；
55.(viii)核苷酸-寡聚結構域(nod)樣配體，其選自：nod1激動劑(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激動劑(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羥乙酰基-mdp)和nod1/nod2激動劑(m-tridap,pgn)；
56.(ix)一個或一個以上rig-i樣受體(rlr)的配體，其選自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；
57.(x)一個或一個以上c型植物凝集素受體(clr)的配體，其選自：凝膠多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山崳酸鹽；
58.(xi)一個或一個以上細胞溶質dna傳感器(cds)的配體，其選自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:
dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；或
59.(xii)炎性體誘導物，其選自：(a)nlrp3炎性體蛋白質復合物，優選地為明礬晶體，atp，cppd晶體，hermozoin，msu晶體，納米sio2，尼日利亞菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性體蛋白質復合物，優選地為poly(da:dt)。
60.在一些實施方式中，所述活化部分包含imo2134、imo205、mgn-1703、mgn-1704、agatolimod、sd-101、qax-935、dims0150、pollinex quattro、om-174、eritoran、tak-242、ni-0101、i型干擾素、ii型干擾素、iii型干擾素、il-12、il-23、il-18、il-7或il-15。
61.通過引用的合并
62.說明書中提到的所有公開出版物、專利和專利申請在此通過引用并入本文，如同具體地且單獨地說明通過引用將每個單獨的公開出版物、專利或專利申請并入本文一樣。
附圖說明
63.本發明的新特點在所附的權利要求書中具體說明。通過參考后面列舉的對示例性的實施方式的詳細描述可更好地對本發明的特點和優勢加以理解，其中，使用了本發明的原理，并且具有如下附圖：
64.圖1表示偶聯的化合物的特性。如通過facs分析所確定的，將曲妥珠單抗mc-vc-瑞喹莫德和曲妥珠單抗-瑞喹莫德偶聯物與表達her2的l細胞的結合與未偶聯的曲妥珠單抗(作為參比)、對照人igg和不相關人igg1抗體比較。
65.圖2表示曲妥珠單抗、曲妥珠單抗mc-vc-tlrl和曲妥珠單抗mc-tlrl偶聯物的體外抗體依賴性細胞毒性(adcc)分析。pbmc(效應細胞)與skbr3細胞(靶細胞)一同加至含有不同濃度的對照人igg1、曲妥珠單抗或曲妥珠單抗mc-vc-tlrl和曲妥珠單抗mc-tlrl偶聯物的96孔平板(靶標/效應物比例為1/60)中持續17小時。所有實驗一式兩份進行。分析基于陰性skbr3測定。用ldh對死細胞進行染。
66.圖3a表示富集前后的dc百分數。上部的兩個圖中的數字表示譜系消減前后總細胞中的dc(hla-dr+lin-)百分數。下部圖中的數字表示譜系消減前后總dc中的mdc(cd11c+cd123-)和pdc(cd123+cd11c-)的百分數。圖3b至圖3d表示純化的人dc的細胞因子產量分析。純化的人dc被接種在96孔平板中并且與異基因的未處理的(培養基)或處理的不同濃度的tlrl或曲妥珠單抗mc-vc-tlrl和曲妥珠單抗mc-tlrl在37℃下的孵育箱中直接培養20小時至22小時。在另一實驗中，提供濃度逐漸增加的西妥昔單抗mc-vc-tlrl和西妥昔單抗mc-tlrl與人dc一同處理。收集上清液，通過elisa分析人ifn-α，il-6，il-12(p70)和tnf-α。數據表示為一式三份的培養物的平均值
±
sd并且數據代表來自三個健康供體中的兩個的獨立的實驗。
67.圖4a至圖4c表示pdx胃腫瘤模型中曲妥珠單抗mc-vc-tlrl和曲妥珠單抗mc-tlrl的效果。皮下帶有來源于患者的胃腫瘤的6至8周齡的雌性balb/c裸鼠(nu/nu)通過靜脈注射10mg/kg曲妥珠單抗mc-vc-tlrl，曲妥珠單抗mc-tlrl或未偶聯的曲妥珠單抗或鹽水進行(每組12只小鼠)。每周進行持續45天的周期。當腫瘤達到平均尺寸為170mm3時開始。圖4a：數據表示平均腫瘤體積(平均值
±
sd)。當腫瘤達到尺寸為2000mm3時腫瘤生長曲線停止。圖4b：過程中和后小鼠體重的變化。沒有觀察到可檢測的失重。圖4c：組和對照組的存活曲線；接受曲妥珠單抗mc-vc-tlrl或未偶聯的曲妥珠單抗的
小鼠的壽命大幅度延長。
68.圖5a至圖5b表示裸鼠/h1650人肺癌模型中西妥昔單抗mc-vc-tlrl的療效。皮下帶有h1650肺癌細胞的6至8周齡雌性balb/c裸鼠(nu/nu)通過靜脈注射10mg/kg西妥昔單抗mc-vc-tlrl或未偶聯的西妥昔單抗或鹽水進行(每組12只小鼠)。每周進行持續45天的周期。當腫瘤達到平均尺寸為170mm3時開始。數據表示平均腫瘤體積(平均值
±
sd)。當腫瘤達到尺寸為2000mm3時腫瘤生長曲線停止。圖5a：人肺癌模型中西妥昔單抗mc-vc-tlrl的療效。圖5b：過程中和后小鼠體重的變化。沒有觀察到可檢測的失重。
具體實施方式
69.本發明的許多方面參考用于舉例說明的示例性應用在下面進行描述。應當理解的是，列舉出許多具體的細節、關系以及方法來全面理解本發明。然而，本領域普通技術人員可容易地意識到本發明可不按照具體細節中的一種或一種以上來實施或者可以其他方法來實施。本發明不受舉例說明的操作順序或事件的限制，因為，一些操作可以不同的順序進行和/或可同時與其他操作或事件一同進行。
70.進一步地，不是所有舉例說明的操作或事件都需要根據本發明的方法來實施。
71.本文使用的術語是僅僅是為了說明具體實施方式，而無意限定本發明。除非另有明確說明，如本文使用的不指明具體數目的冠詞(“a”，“an”和“the”)意在包括復數形式。此外，在具體實施方式部分和/或權利要求中使用的術語“包括(“including”，“include”)、具有(“having”，“has”，“with”)或其變體意在包括與術語“包含(comprising)”類似的方式。
72.術語“約”或“大約”是指由本領域普通技術人員測定的特定值在可接受的誤差范圍內，該誤差范圍部分取決于該值如何測量或確定，即，測量系統的限制。例如，“約”可意味著在本領域中每一操作在1個標準偏差范圍內或超過一個標準偏差。可選地，“約”可意味著高達給定值的20％的范圍，優選地高達給定值的10％的范圍，更優選地高達給定值的5％的范圍并且更優選地高達給定值的1％的范圍。可選地，尤其對于生物系統或過程而言，該術語可意味著在某個值的某個數量級范圍內，優選地在某個值的5倍范圍內，更優選地在某個值的2倍范圍內。在本技術和權利要求書中描述特定值的條件下，除非另有說明，應當假定術語“約”意味著在特定值的可接受的誤差范圍內。
73.i.定義和縮寫
74.除非另有說明，本文使用的所有技術術語和科學術語通常具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。總體而言，本文使用的命名系統和細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交中的實驗操作是本領域熟知的且普遍使用的那些命名系統和實驗操作。標準技術用于核酸和肽的合成。所述技術和操作通常根據本領域的常規方法和各種不同的常規參考文獻進行，本領域的常規方法和各種不同的常規參考文獻在本文中提供。本文使用的命名系統和下面描述的分析化學和有機合成中的實驗操作是本領域熟知的且普遍使用的命名系統和實驗操作。標準技術或其改良用于化學合成和化學分析。
75.除非另有說明，術語“烷基”其自身或作為另一取代基的一部分是指含有指定數目的碳原子(即，c
1-c
10
是指1至10個碳原子)的直鏈或支鏈或環狀烴自由基或者其組合，所述直鏈或支鏈或環狀烴自由基或者其組合可為完全飽和的、單不飽和的或多不飽和的并且可
包括二價和多價自由基。飽和的烴自由基的實例包括但不限于如下基團，例如，甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、其同系物或異構體，例如，n-戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基等等。不飽和烷基為具有一個或一個以上雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高級同系物和異構體。除非另有說明，術語“烷基”還意在包括下面更加詳細定義的那些烷基衍生物，例如，“雜烷基”。限定為烴基的烷基基團被稱為“均烷基(homoalkyl)”。
76.術語“亞烷基”其自身或作為另一取代基的一部分是指從烷烴衍生得到的二價自由基，例如，但不限于：-ch2ch2ch2ch
2-，并且還包括下面如“雜亞烷基”所描述的那些基團。通常，烷基(或亞烷基)基團可具有1至24個碳原子，本發明中優選地為具有10個或更少的碳原子的那些基團。“低級烷基”或“低級亞烷基”是較短鏈烷基或亞烷基基團，通常具有8個或更少的碳原子。
77.術語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常規含義使用，并且分別是指通過氧原子、氨基基團或硫原子與分子的剩余部分連接的那些烷基基團。
78.除非另有說明，術語“雜烷基”其自身或與另一術語結合是指由規定數目的碳原子和至少一個選自o、n、si和s的雜原子構成的、穩定的直鏈或支鏈或環狀烴自由基或者其組合，并且，其中，氮和硫原子可被任選地氧化并且氮雜原子可被任選地季銨化。雜原子o、n和s以及si可位于雜烷基的任何內部位置或者位于烷基與分子的剩余部分連接的位置。實例包括但不限于：-ch
2-ch
2-o-ch3,-ch
2-ch
2-nh-ch3,-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3,-ch
2-s-ch
2-ch3,-ch
2-ch2,-s(o)-ch3,-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3,-ch＝ch-o-ch3,-si(ch3)3,-ch
2-ch＝n-och3,和-ch＝ch-n(ch3)-ch3。最多兩個雜原子可以連續，例如，-ch
2-nh-och3和-ch
2-o-si(ch3)3。類似地，術語“雜亞烷基”其自身或作為另一取代基的一部分是指從雜烷基衍生得到的二價自由基，例如但不限于：-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和
–
ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。對于雜亞烷基基團而言，雜原子還可占據鏈端中的一個末端或者鏈端的兩個末端(例如，亞烷基氧、亞烷基二氧、亞烷基氨基、亞烷基二氨基，等等)。而且，對于亞烷基和雜亞烷基的連接基團而言，所寫的連接基團的分子式中的方向并不暗示連接基團的方向。例如，分子式-c(o)2r
’?
代表-c(o)2r
’?
和-r’c(o)
2-。
79.一般而言，“酰基取代基”也選自上面列舉的基團。如本文使用的術語“酰基取代基”是指連接至本發明的化合物的多環核心的基團且該基團滿足直接或間接地連接至本發明的化合物的多環核心的羰基碳的化合價。
80.除非另有說明，術語“環烷基”和“雜環烷基”其自身或者與其他術語的組合分別表示“烷基”和“雜烷基”的環狀形式。此外，對于雜環烷基而言，雜原子可占據雜環與分子的剩余部分連接的位置。環烷基的實例包括但不限于：環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基，等等。雜環烷基的實例包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-基、2-基、3-基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基，等等。
81.除非另有說明，術語“鹵代”或“鹵素”其自身或作為另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。此外，諸如“鹵代烷基”之類的術語意在包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例
c4)烷基,數量為0至芳香族環系統上開放的化合價的總數，并且其中r’,r”,r
”’
和r
””
優選地獨立地選自：氫、(c
1-c8)烷基和雜烷基、未取代的芳基和雜芳基，(未取代的芳基)-(c
1-c4)烷基以及(未取代的芳基)氧-(c
1-c4)烷基。例如，當本發明的化合物包含一個以上r基團時，r基團中的每一個獨立地選自各r’,r”,r
”’
和r
””
基團(當存在這些基團中的一個以上時)。
87.芳基環或雜芳基環的相鄰原子上的芳基取代基中的兩個可任選地被通式
–
t-c(o)-(crr’)
q-u-的取代基取代，其中，t和u獨立地為-nr-，-o-,-crr
’?
或單個化學鍵，并且q為0至3的整數。可選地，芳基環或雜芳基環的相鄰原子上的取代基中的兩個可任選地被通式
–
a-(ch2)
r-b-的取代基取代，其中，a和b獨立地為
–
crr
’?
,-o-,-nr-,-s-,-s(o)-,-s(o)
2-,-s(o)2nr
’?
或單個化學鍵，并且r為1至4的整數。由此形成的新環中的單個化學鍵中的一個可被雙鍵任選地取代。可選地，芳基環或雜芳基環的相鄰原子上的取代基中的兩個可任選地被通式
–
(crr’)
s-x-(cr”r
’”
)
d-的取代基取代，其中，s和d獨立地為0至3的整數，并且x為-o-，-nr
’?
,-s-,-s(o)-,-s(o)
2-,或
–
s(o)2nr
’?
。取代基r,r’,r”和r
”’
優選地獨立地選自氫或者取代或未取代的(c
1-c6)烷基。
88.如本文使用的術語“雜原子”包括氧(o)、氮(n)、硫(s)、磷(p)和硅(si)。
89.ii.組合物
90.一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
91.tm-ln-am
??
(i)，
92.其中，tm為靶向部分，am為能夠活化人樹突細胞、nk細胞或腫瘤細胞或者它們的組合的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數。
93.另一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
94.tm-ln-am
??
(i)，
95.其中，tm為靶向部分，am為能夠特異性結合人tlr7和/或人tlr8的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數。
96.又一方面，本發明提供一種具有通式(i)的結構的化合物：
97.tm-ln-am
??
(i)，
98.其中，tm為靶向部分，am為活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數，條件是當tm包含抗體時，am不包含cpg寡核苷酸或劑。
99.a.靶向部分
100.總體而言，本發明的化合物包含靶向部分。
101.本文中的“靶向部分(tm)”或“靶向劑”是指特異性地或選擇性地與目標分子、細胞、顆粒、組織或聚集體結合的分子、復合物或聚集體，所述目標分子、細胞、顆粒、組織或聚集體通常稱為“靶標”或“標記物”并且本文將進一步詳細討論這些目標分子、細胞、顆粒、組織或聚集體。
102.在一些實施方式中，靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白質、肽、小分子、納米顆粒或核酸。
103.諸如抗體(例如，嵌合抗體、人源化抗體和人抗體)、受體的配體、植物凝集素和糖類以及一些酶的底物之類的示例性的靶向劑在本領域中被識別并且不受限制地用于實施本發明。其他靶向劑包括一類如下化合物：該化合物不包括特異性分子識別基序，該化合物
包括將分子量加至活化部分的納米顆粒、諸如聚(乙二醇)之類的大分子、多糖，以及聚氨基酸。額外的分子量影響活化部分的藥代動力學，例如血清半衰期。
104.在一些實施方式中，靶向部分為抗體，抗體片段，雙特異性抗體或其他基于抗體的分子或化合物。然而，靶向部分的其他實例為本領域已知的并且可使用靶向部分的其他實例，例如，適體、avimer、受體結合配體、核酸、生物素-親和素結合對、結合肽或蛋白質，等等。術語“靶向部分”和“結合部分”在本文中同義使用。
105.靶標
106.本文中的“靶標”或“標記物”是指能夠特異性結合特定的靶向部分的任何實體。在一些實施方式中，靶標與一個或一個以上特定細胞或組織類型特別相關。在一些實施方式中，靶標與一種或一種以上特定疾病狀態特別相關。在一些實施方式中，靶標與一種或一種以上特定發育階段特別相關。例如，細胞類型特異性標記物在該細胞類型中的表達水平通常比在參比細胞中的表達水平高至少兩倍。在一些實施方式中，細胞類型特異性標記物的水平比在參比中的平均表達高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1,000倍。細胞類型特異性標記物的檢測或測量可將一種目標細胞類型或多種目標細胞類型與許多其他細胞類型、大多數其他細胞類型或所有其他細胞類型區分開。在一些實施方式中，靶標可包含本文所描述的蛋白質、碳水化合物、脂質和/或核酸。
107.如果一種物質與核酸的靶向部分特異性結合，那么該物質可被認為是為了本文所述的目的而“被靶向的”。在一些實施方式中，核酸靶向部分在嚴格條件下與靶標特異性結合。如果靶向部分與靶標特異性結合，那么含有靶向部分的本發明的復合物或化合物被認為是“被靶向的”，從而將整個復合物或化合物組合物遞送至特定的器官、組織、細胞、細胞外基質成分和/或細胞內腔室。
108.在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分特異性結合與器官、組織、細胞、細胞外基質成分和/或細胞內腔室有關的一個或一個以上靶標(例如，抗原)。在一些實施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特異性結合與特定器官或器官系統有關的靶標。在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含核靶向部分，該核靶向部分特異性結合一個或一個以上細胞內靶標(例如，細胞器、細胞內蛋白質)。在一些實施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特異性結合與病態的器官、組織、細胞、細胞外基質成分和/或細胞內腔室有關的靶標。在一些實施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特異性結合與特定細胞類型(例如，內皮細胞、癌細胞、惡性癌細胞、前列腺癌細胞，等等)有關的靶標。
109.在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分與對一種或一種以上特定組織類型(例如，肝臟組織和前列腺組織)具有特異性的靶標結合。在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分與對一種或一種以上特定細胞類型(例如，t細胞和b細胞)具有特異性的靶標結合。在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分與對一種或一種以上特定疾病狀態(例如，腫瘤細胞和健康細胞)具有特異性的靶標結合。在一些實施方式中，根據本發明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分與對一種或一種以上特定發育階段(例如，干細胞和分化的細胞)具有特異性的靶標結合。
110.在一些實施方式中，靶標可為標記物，所述標記物僅僅或主要與一種或幾種細胞類型、一種或幾種疾病和/或一種或幾種發育階段有關。細胞類型特異性標記物在該細胞類型中的表達水平通常比在參比細胞中的表達水平高至少兩倍，例如，所述參比細胞可由含有幾乎等量的來自多種(例如，5-10種，或者更多)不同的組織或器官的細胞的混合物構成。在一些實施方式中，細胞類型特異性標記物的表達水平比在參比中的平均表達水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。細胞類型特異性標記物的檢測和測量可將一種目標細胞類型或多種目標細胞類型與許多其他細胞類型、大多數其他細胞類型或所有其他細胞類型區分開。
111.在一些實施方式中，靶標包含蛋白質、碳水化合物、脂質和/或核酸。在一些實施方式中，靶標包含蛋白質和/或其特征部分，例如，腫瘤標記物、整聯蛋白、細胞表面受體、跨膜蛋白、細胞間蛋白、離子通道、膜轉運蛋白、酶、抗體、嵌合蛋白、糖蛋白，等等。在一些實施方式中，靶標包含碳水化合物和/或其特征部分，例如，糖蛋白，糖(例如，單糖、二糖、多糖)、多糖包被(即，大多數真核細胞的外表面上富集碳水化合物的外周區域)，等等。在一些實施方式中，靶標包含脂質和/或其特征部分，例如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、類固醇(例如，膽固醇、膽汁酸)、維生素(例如，維生素e)、磷脂、神經鞘脂、脂蛋白，等等。在一些實施方式中，靶標包含核酸和/或其特征部分，例如，dna核酸、rna核酸、修飾的dna核酸、修飾的rna核酸、包括dna、rna、修飾的dna和修飾的rna的任何組合在內的核酸。
112.本領域已知多種標記物。典型的標記物包括細胞表面蛋白質，例如，受體。示例性的受體包括但不限于：轉鐵蛋白受體、ldl受體、生長因子受體(例如，表皮生長因子受體家族成員(例如，egfr、her2、her3、her4))或血管內皮生長因子受體、細胞因子受體、細胞粘附分子、整聯蛋白、選擇素和cd分子。所述標記物可為僅僅存在于或大量存在于惡性腫瘤細胞上的分子，例如，腫瘤抗原。
113.腫瘤抗原
114.在一些實施方式中，靶向部分能夠特異性結合腫瘤細胞或相對于非腫瘤細胞優先結合腫瘤細胞。
115.靶向部分與腫瘤細胞的結合可使用本領域已知的檢測方法來測量。
116.在一些實施方式中，腫瘤細胞為癌細胞、肉瘤細胞、淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞或中樞神經系統癌癥細胞。
117.在一些實施方式中，靶向部分能夠特異性結合腫瘤抗原或者相對于非腫瘤抗原優先結合腫瘤抗原。
118.本文中的“特異性結合”或“優先結合”是指在兩個結合搭檔之間(例如，在靶向部分及其結合搭檔之間)的結合對兩個結合搭檔具有選擇性并且可從不想要的或非特異性相互作用中區分出來。例如，抗原結合部分結合特異性抗原決定簇的能力可通過酶聯免疫吸附分析法(elisa)或其他本領域技術人員熟悉的技術(例如，表面等離子共振技術(在biacore儀器上分析)(liljeblad等人,glyco j 17,323-329(2000))和傳統的結合分析(heeley,endocr res 28,217-229(2002)))測量。術語“抗-[抗原]抗體”和“與[抗原]結合的抗體”是指能夠通過足夠的親合力結合各自的抗原的抗體，這樣，所述抗體用作靶向抗原的診斷劑和/或劑。在一些實施方式中，抗-[抗原]抗體結合不相關的蛋白質的程度小
于所測量(例如，通過放射性免疫分析(ria))的抗體抗原結合程度的約10％。在一些實施方式中，結合[抗原]的抗體的解離常數(kd)小于1μm、小于100nm、小于10nm、小于1nm、小于0.1nm、小于0.01nm或小于0.001nm(例如，10-8
m或更小，例如，10-8
m至10-13
m，例如，10-9
m至10-13
m)。應當理解的是，上述定義還可應用于與抗原結合的抗原結合部分。
[0119]
在一些特定的實施方式中，靶標為腫瘤標記物。在一些實施方式中，腫瘤標記物為存在于腫瘤中的抗原，所述抗原不存在于正常器官、組織和/或細胞中。在一些實施方式中，腫瘤標記物為抗原，所述抗原在腫瘤中比在正常器官、組織和/或細胞中更加普遍。在一些實施方式中，腫瘤標記物為抗原，所述抗原在惡性癌癥細胞中比在正常細胞中更加普遍。
[0120]
本文中的“腫瘤抗原”是指腫瘤細胞中產生的抗原性物質，即，該物質觸發宿主體內的免疫反應。體內的正常蛋白質由于自體耐受而不是抗原性的，所述自體耐受為如下過程：在該過程中，自身反應性的細胞毒性t淋巴細胞(ctl)和產生自身抗體的b淋巴細胞在初級淋巴組織(bm)中被“中心性地”剔除并在次級淋巴組織(產生t細胞的大多數胸腺和產生b細胞的脾/淋巴結)中被“外周性地”剔除。因此，未暴露于免疫系統的任何蛋白質觸發免疫反應。這可包括與免疫系統完全隔絕的正常蛋白質、以極少的量正常生成的蛋白質、僅僅在某些發育階段正常生成的蛋白質或者結構由于突變而發生改變的蛋白質。
[0121]
在一些實施方式中，相對于在正常組織和/或細胞中的表達，靶標優先在腫瘤組織和/或細胞中表達。
[0122]
在本發明的一些實施方式中，標記物為腫瘤標記物。所述標記物可為多肽，所述多肽在分裂的細胞中的表達水平比在未分裂的細胞中的表達水平高。例如，her-2/neu(也稱為erbb-2)為egf受體家族成員并在與乳腺癌相關的腫瘤細胞表面表達。另一實例為稱為f3的肽，該肽為用于將納米顆粒引向核仁蛋白的合適的靶向劑(porkka et al.,2002,proc.natl.acad.sci.,usa,99:7444；and christian等人,2003,j.cell biol.,163:871)。包含納米顆粒和a10適體(與psma特異性結合)的靶向顆粒表現出能夠特異性且有效地將多西他賽遞送至前列腺癌腫瘤。
[0123]
特異性靶向這些腫瘤靶標的抗體或其他藥物特異性地干擾并調節腫瘤細胞生物行為的信號通路，直接調節或阻斷信號通路，從而抑制腫瘤細胞生長或誘導細胞凋亡。迄今為止，已批準了幾十種靶向藥物用于實體瘤或血液系統惡性腫瘤的臨床研究和，并且已有多種用于血液系統惡性腫瘤的靶向藥物。
[0124]
在一些實施方式中，腫瘤抗原(或腫瘤靶標)選自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。
[0125]
在一些實施方式中，腫瘤抗原(或腫瘤靶標)選自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纖連蛋白,葉酸鹽受體,神經節苷酯gm3,gd2,糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整聯蛋白αν,整聯蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y抗原,間皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘連蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配體蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它們的變體。腫瘤抗原的變體包括本領域已知的和/或天然生成的各種不同的突變體或多形態。
[0126]
抗體
[0127]
在一些實施方式中，靶向部分包含抗體或其功能片段。
[0128]
本文使用的“免疫球蛋白”或“抗體”是指全長(即，天然生成的或通過正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性結合)部分，例如抗體片段。在本發明要求保護的范圍內，抗體或抗體片段可被偶聯或衍生。這些抗體包括iggl,lgg2a,igg3,igg4(以及igg4亞型)和iga同種型。
[0129]
本文的術語“抗體”以其廣義使用并包含各種不同的抗體結構，包括但不限于：單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出期望的抗原結合活性并且包含免疫球蛋白的fc區域或等同于該fc區域的區域。本文中可互換使用的術語“全長抗體”、“完整抗體”和“整個抗體”是指具有與天然抗體結構基本類似的結構的抗體或者具有含本文定義的fc區域的重鏈的抗體。
[0130]
本文的“天然抗體”是指具有不同結構的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗體為約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由被二硫鍵連接的兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈構成。從n端至c端，每一重鏈具有可變區(vh)，也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，重鏈之后為三個恒定結構域(ch1、ch2和ch3)，也稱為重鏈恒定區。類似地，從n端至c端，每一輕鏈具有可變區(vl)，也稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，輕鏈之后為恒定輕鏈結構域(cl)，也稱為輕鏈恒定區。基于抗體恒定結構域的氨基酸序列，抗體的輕鏈可指定為兩種類型(稱為κ和λ)中的一種。
[0131]
本文中的“抗體片段”是指不同于完整抗體的分子，所述分子包含結合抗原的完整抗體的一部分，所述抗原與完整抗體結合。抗體片段的實例包括但不限于：fv,fab,fab',fab'-sh,f(ab')2,雙體抗體,線性抗體,單鏈抗體分子(例如，scfv),單結構域抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。關于一些抗體片段的綜述請參見，hudson等人,nat med 9,129-134(2003)。關于scfv片段的綜述請參見例如，pliickthun,in the pharmacology of monoclonal antibodies,vol.113,rosenburg和moore編輯,springer-verlag,new york,pp.269-315(1994)；以及wo 93/16185；和美國專利第5,571,894號和第5,587,458號。關于含有挽救受體結合表位殘基且具有提高的體內半衰期的fab和f(ab’)2片段的討論，請參見美國專利第5,869,046號。雙體抗體為可為二價的或雙特異性的具有兩個抗原結合位點的抗體片段。請參見例如，ep 404,097；wo 1993/01161；hudson等人,nat med 9,129-134(2003)；和hollinger等人,proc natl acad sci usa 90,6444-6448(1993)。三體抗體和四體抗體也在hudson等人,nat med 9,129-134(2003)中描述。單結構域抗體為含有抗體的所有或一部分重鏈可變結構域或者含有抗體的所有或一部分輕鏈可變結構域的抗體片段。在一些實施方式中，單結構域抗體為人單結構域抗體(domantis,inc.,waltham,ma；參見例如，美國專利no.6,248,516bl)。抗體片段可通過各種不同的技術制備，所述技術包括但不限于：如本文描述的，完整抗體的蛋白水解消化以及通過重組宿主細胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)生成。
[0132]
本文中的“抗原結合結構域”是指包含與抗原的全部或一部分特異性結合且互補的區域的抗體的一部分。抗原結合結構域可通過例如，一個或一個以上抗體可變結構域(也稱為抗體可變區)來提供。具體而言，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(vl)和抗體重鏈可變區(vh)。
[0133]
本文中的“可變區”或“可變結構域”是指涉及使抗體與抗原結合的抗體重鏈結構域或輕鏈結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別為vh和vl)通常具有類似的結構，其中，每一結構域包含四個保守的框架區(fr)和三個高變區(hvr)。參見例如，kindt等人,kuby immunology,第六版,w.h.freeman and co.,第91頁(2007)。單個vh或vl結構域可足以帶來抗原結合特異性。
[0134]
本文中的“高變區”或“hvr”是指序列高度可變和/或形成結構限定的環(“高變環”)的抗體可變結構域的各個區域。一般而言，天然四鏈抗體包含六個hvr，三個在vh(h1、h2、h3)中，三個在vl(l1、l2、l3)中。hvr通常包含來自高變環的氨基酸殘基和/或來自互補決定區(cdr)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列可變性和/或涉及抗原識別。除了vh中的cdr1，cdr通常包含形成高變環的氨基酸殘基。高變區(hvr)也被稱為“互補決定區(cdr)”并且與形成抗原結合區的可變區部分有關的這些術語在本文中互換使用。該特定區域已由kabat等人,u.s.dept.of health and human services,sequences of proteins of immunological interest(1983)和chothia等人,jmol biol 196:901-917(1987)描述，其中，當彼此比較時，定義包括氨基酸殘基的重疊或子集。然而，關于抗體的cdr或其變體的任何定義的應用意在本文定義的和本文使用的術語的范圍內。包含特定cdr的確切的殘基數目隨cdr的序列和尺寸的不同而不同。在給出抗體的可變區氨基酸序列的條件下，本領域技術人員可常規確定哪些殘基包含特定cdr。
[0135]
本發明的抗體可為嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或抗體融合蛋白。
[0136]
本文中的“嵌合抗體”是指包含抗體重鏈和輕鏈這兩者的可變結構域的重組蛋白質，所述可變結構域包括來源于一個物種的抗體(優選地為嚙齒動物抗體，更優選地為鼠科動物抗體)的互補決定區(cdr)，而抗體分子的恒定結構域來源于人抗體的恒定結構域。對于獸醫應用而言，嵌合抗體的恒定結構域可來源于其它物種的恒定結構域，所述其它物種例如，類人類靈長類動物、貓或狗。
[0137]
本文中的“人源化抗體”是指如下重組蛋白：在該重組蛋白中，來自于一個物種的抗體(例如，嚙齒動物抗體)的cdr從嚙齒動物抗體的可變重鏈和可變輕鏈轉移至人重鏈可變結構域和人輕鏈可變結構域中。抗體分子的恒定結構域來源于人抗體的恒定結構域。在一些實施方式中，人源化抗體的框架區的特定殘基，尤其是接觸或靠近cdr序列的那些特定殘基，可被修飾，例如可被來自于原始嚙齒動物、類人類靈長類動物的相應殘基或其他抗體代替。
[0138]
本文中的“人抗體”是指例如從轉基因小鼠中獲得的抗體，所述轉基因小鼠已被“改造”為響應抗原刺激生成特定的人抗體。在該技術中，人重鏈基因座和人輕鏈基因座的元件被引入來源于胚胎干細胞系的小鼠品系中，所述胚胎干細胞系包含內源性重鏈基因座和輕鏈基因座的靶向斷裂。轉基因小鼠可合成對人抗原具有特異性的人抗體，并且小鼠可用于生成分泌人抗體的雜交瘤。從轉基因小鼠中獲得人抗體的方法由green等人,nature genet.7:13(1994)，lonberg等人,nature 368:856(1994)，taylor等人,int.immun.6:579(1994)描述。完全人抗體還可通過基因轉染法或染體轉染法以及噬菌體展示技術來構建，所有這些方法為本領域已知的。請參見例如，mccafferty等人,nature 348:552-553(1990)，其中描述了通過來自于未免疫的供體的免疫球蛋白可變結構域基因譜系體外生成人抗體及其片段。在該技術中，抗體可變結構域基因框內克隆至絲狀噬菌體的主要或次要
外殼蛋白基因中，并且在噬菌體顆粒的表面上展示為功能抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，基于抗體的功能性質的選擇還導致對編碼表現出那些性質的抗體的基因的選擇。通過該方式，噬菌體模仿b細胞的一些性質。噬菌體展示可以多種形式進行，關于噬菌體展示的綜述請參見例如，johnson和chiswell,current opinion in structural biology 3:5564-571(1993)。人抗體還可通過體外活化b細胞產生。請參見美國專利第5,567,610號和第5,229,275號，該美國專利的全部內容通過引用并入本文。
[0139]
本文中的“抗體融合蛋白”是指通過重組產生的抗原結合分子，其中，連接相同或不同的天然抗體、具有相同或不同特異性的單鏈抗體或抗體片段中的兩個或兩個以上。融合蛋白包含至少一個特異性結合位點。融合蛋白的化合價表示融合蛋白具有的與抗原或表位結合的結合臂或結合位點的總數，即，單價的、二價的、三價的或多價的。多價的抗體融合蛋白是指該抗體融合蛋白可利用多種與抗原結合的相互作用，因此增加與抗原或不同抗原結合的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能夠與多少種不同類型的抗原或表位結合，即，單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，天然抗體(例如，igg)為二價的，因為其具有兩個結合臂，但是其為單特異性的，因為其結合一種類型的抗原或表位。單特異性多價融合蛋白具有一個以上用于相同抗原或表位的結合位點。例如，單特異性雙體抗體為具有兩個與相同的抗原反應的結合位點的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗體成分的多價或多特異性組合或同一抗體成分的多個拷貝。融合蛋白還可包含劑。
[0140]
在一些實施方式中，靶向部分為抗體或抗體片段，該靶向部分基于其對抗原的特異性進行選擇，所述抗原在目標靶細胞或靶點上表達。已識別出多種不同的腫瘤特異性抗原或其他疾病特異性抗原，并且那些抗原的抗體已用于或計劃用于這些腫瘤或其他疾病。本領域已知的抗體可用于本發明的化合物，尤其用于與靶抗原有關的疾病。可被本發明的抗體-連接體-藥物偶聯物靶定的目標抗原(及其相關疾病)的實例包括：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79，cd137，4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纖連蛋白,葉酸鹽受體,神經節苷酯gm3,gd2,糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整聯蛋白αν,整聯蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y,間皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘連蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配體蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3。
[0141]
在一些實施方式中，抗體選自：美羅華(利妥昔單抗)、赫賽汀(曲妥珠單抗)、愛必妥(西妥昔單抗)、維克替比(帕尼單抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(貝利木單抗)、yervoy(伊匹單抗)、perjeta(帕妥珠單抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。
[0142]
美羅華(利妥昔單抗)為用于b細胞非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗體。其作用于表達cd20抗原的b細胞表面，cd20抗原在90％的b細胞非霍奇金淋巴瘤上表達。美羅華與cd20結合，從而誘導b細胞通過cdc和adcc溶解并且敏化對一些細胞毒性化療具有耐藥性的人淋巴細胞。
[0143]
赫賽汀(曲妥珠單抗)為作用于her2人表皮生長因子受體細胞外結構域的人源化
單克隆抗體，her2在25％至30％的乳腺癌中表達。曲妥珠單抗被認為具有通過以下三方面的抗腫瘤作用：(1)下調her2受體，抑制her2細胞內信號轉導通路以及誘導細胞凋亡；(2)使抗體依賴性adcc和cdc與殺傷腫瘤細胞相關聯的免疫機制；(3)提高化療效果。
[0144]
愛必妥(西妥昔單抗)為作用于表皮生長因子受體(egfr)的嵌合抗體。愛必妥結合egfr，從而抑制egfr的信號轉導通路，影響細胞增殖、浸潤和轉移，以及血管生成。對egfr信號轉導通路的抑制可提高化療藥物的療效和放療的療效。
[0145]
阿瓦斯汀(貝伐單抗)為靶定血管內皮生長因子(vegf)的人源化單克隆抗體。阿瓦斯汀與vegfr的結合抑制vegf和信號轉導，從而抑制了腫瘤血管生成。
[0146]
目前正在研發的其他抗體也可用作靶向部分。例如，正在研發用于腫瘤的針對下列靶標的性單克隆抗體：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79，cd137。并且也正在研發用于腫瘤的針對下列靶標的性單克隆抗體：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纖連蛋白,葉酸鹽受體,神經節苷酯gm3,gd2,糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整聯蛋白αν,整聯蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis,間皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘連蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配體蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3，以及它們的變體。(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.2012mar 22；12(4):278-87)。
[0147]
在一些實施方式中，靶向部分包含fab，fab’，f(ab’)2，單結構域抗體，t和abs二聚物，fv，scfv，dsfv，ds-scfv，fd，線性抗體，微小抗體、雙體抗體、雙特異性抗體片段、bibody、tribody、sc-雙體抗體、κ(λ)body，bite，dvd-ig，sip，smip，dart，或者含有一個或一個以上cdr的抗體類似物。
[0148]
下表顯示正在研究的各種不同的抗體結構和靶標：
[0149]
表1
[0150]
[0151][0152]
在一些實施方式中，靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反應蛋白-1模擬物、cdcrgdcfcg(環狀)多肽、sch 221153片段、ncngrc(環狀)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奧曲肽、伐普肽、蘭樂肽、c-3940多肽、達必佳、利普安、諾雷德或西曲瑞克。
[0153]
葉酸
[0154]
在一些實施方式中，靶向部分包含葉酸或其衍生物。
[0155]
近年來，關于葉酸的研究取得了很大進步。葉酸為一種細胞分裂必需的小分子維生素。腫瘤細胞分裂異常，葉酸鹽受體(fr)在腫瘤細胞表面高表達以捕獲足以支持細胞分裂的葉酸。
[0156]
數據顯示fr在腫瘤細胞中的表達比在正常細胞中的表達高20倍至200倍。fr在各種不同的惡性腫瘤中的表達率為：在卵巢癌中為82％，在非小細胞肺癌中為66％，在腎癌中為64％，在結腸癌中為34％，在乳腺癌中為29％(xia w，low ps.late-targeted therapies for cancer.j med chem.2010；14；53(19):6811-24)。fa的表達率和上皮腫瘤浸潤和轉移的惡性程度正相關。fa通過fr介導的內吞作用進入細胞，并且fa通過其羧基基團與進入細胞的藥物形成fa復合物。在酸性(ph值為5)條件下，fr從fa中分離出來，并且fa將藥物釋放進入細胞質。
[0157]
臨床上，此系統可用于遞送選擇性攻擊腫瘤細胞的藥物。葉酸具有小分子量，不具有免疫原性且具有高穩定性，并且葉酸的合成并不昂貴。更重要的是，藥物和載體之間的化學偶聯簡單，因此，使用fa作為靶向分子構建藥物遞送系統用于癌癥已成為研究熱點。目前，臨床實驗中的ec145(fa化療藥物偶聯化合物)可有效攻擊癌細胞(pribble p和edelman mj.ec145:a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.expert opin.investig.drugs(2012)21:755-761)。
[0158]
其他靶向部分
[0159]
在一些實施方式中，靶向部分包含細胞外結構域(ecd)或pd-1,ctla4,cd47,btla,kir,tim3,4-1bb和lag3的可溶形式，全長的部分表面配體雙調蛋白，β動物纖維素，egf，肝配蛋白，epigen，上皮調節蛋白，igf，神經調節蛋白，tgf，trail或vegf。
[0160]
納米顆粒
[0161]
在一些實施方式中，靶向部分包含顆粒(靶向顆粒)，優選地為納米顆粒，任選地，為連接至靶向分子的靶向納米顆粒，所述靶向分子可特異性結合或優先結合靶標。在一些實施方式中，靶向顆粒其自身引導本發明的化合物(例如，通過在腫瘤細胞或腫瘤組織中的富集)，而無需與其連接額外的靶向分子。
[0162]
本文中的“納米顆粒”是指直徑小于1000nm的任何顆粒。在一些實施方式中，劑和/或靶向分子可與聚合物基體結合。在一些實施方式中，靶向分子可與聚合物基體的表面共價結合。在一些實施方式中，共價結合由連接體介導。在一些實施方式中，劑可與聚合物基體表面結合，封裝在聚合物基體內，被聚合物基體包圍，和/或分散于整個聚合物基體。美國專利第8,246,968號，該美國專利的全部內容在此通過引用并入本文。
[0163]
總體而言，本發明的納米顆粒包含任何類型的顆粒。根據本發明可使用任何顆粒。在一些實施方式中，顆粒為可生物降解的且生物相容的。總體而言，生物相容性物質對細胞無毒。在一些實施方式中，如果將某種物質加至細胞中產生小于細胞死亡的某一閾值的結果，那么認為該物質為生物相容的。在一些實施方式中，如果將某種物質加至細胞中不誘導副作用，那么認為該物質為生物相容的。總體而言，可生物降解的物質為經過相關時間段(例如，數周、數月或者數年)在生理學條件下發生分解的物質。在一些實施方式中，可生物降解的物質為可通過細胞機制進行分解的物質。在一些實施方式中，可生物降解的物質為可通過化學過程分解的物質。在一些實施方式中，顆粒為生物相容且可生物降解的物質。在一些實施方式中，顆粒為生物相容物質，但不為可生物降解的物質。在一些實施方式中，顆粒為可生物降解的物質，但不為生物相容物質。
[0164]
在一些實施方式中，顆粒的粒度大于腎排泄極限(例如，直徑大于6nm的顆粒)。在一些實施方式中，顆粒尺寸為足以避免通過肝臟從血流中清除的大小(例如，直徑小于1000nm的顆粒)。總體而言，顆粒的生理化學特性應當允許靶向顆粒通過降低腎排泄和肝臟清除在血漿中長期循環。
[0165]
通常，理想的是使用尺寸、形狀和/或組成相對均勻的顆粒，這樣，每一顆粒具有類似的性質。例如，至少80％的顆粒，至少90％的顆粒或至少95％的顆粒的直徑或最大尺寸為平均直徑或最大尺寸加減5％，10％或20％。在一些實施方式中，顆粒的尺寸、形狀和/或組成可為不均一的。
[0166]
ζ電位為顆粒表面電勢的測量值。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-50mv至+50mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-25mv至+25mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-10mv至+10mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-5mv至+5mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為0mv至+50mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為0mv至+25mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為0mv至+10mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為0mv至+5mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-50mv至0mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-25mv至0mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-10mv至0mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位為-5mv至0mv。在一些實施方式中，顆粒的ζ電位基本為中性(即，約0mv)。
[0167]
根據本發明可使用多種不同的顆粒。在一些實施方式中，顆粒為球形或類球形。在一些實施方式中，顆粒為球形或類球形。在一些實施方式中，顆粒為扁平的或板狀的。在一些實施方式中，顆粒為立方體或類立方體。在一些實施方式中，顆粒為卵形或橢圓形。在一些實施方式中，顆粒為圓柱形、圓錐形或金字塔形。
[0168]
在一些實施方式中，顆粒為微顆粒(例如，微球)。總體而言，“微顆粒”是指直徑小于1000μm的任何顆粒。在一些實施方式中，顆粒為微微型顆粒(picoparticle)(例如，微微球體)。總體而言，“微微型顆粒”是指直徑小于1nm的任何顆粒。在一些實施方式中，顆粒為脂質體。在一些實施方式中，顆粒為膠束。
[0169]
顆粒可為實心的或中空的并且可包含一個或一個以上層(例如，納米殼，納米環)。在一些實施方式中，每層相對于其他各層具有獨特的組成和獨特的性質。例如，顆粒可具有核/殼結構，其中，核為一層，殼為另一層。顆粒可包含多個不同的層。在一些實施方式中，一層可為充分交聯的，另一層不充分交聯，等等。在一些實施方式中，不同層中的一層，幾層或所有層可包含一種或一種以上待遞送的劑或診斷劑。在一些實施方式中，一層包含待
raton,1992；mathiowitz等人,1987,j.control.release,5:13；mathiowitz等人,1987,reactive polymers,δ:275；以及mathiowitz等人,1988,j.appl.polymer sci.,35:755)。
[0176]
核酸靶向部分
[0177]
在一些實施方式中，靶向部分包含核酸靶向部分。
[0178]
總體而言，核酸靶向部分為結合與器官、組織、細胞、細胞外基質成分和/或細胞內腔室有關的成分(靶標)的任何多核苷酸。
[0179]
在一些實施方式中，核酸靶向部分為適體。
[0180]
適體通常為與特定目標結構結合的多核苷酸，所述特定目標結構與特定器官、組織、細胞、細胞外基質成分和/或細胞內腔室有關。總體而言，適體的靶向功能基于適體的三維結構。在一些實施方式中，適體與靶標的結合通常由適體和靶標這兩者的二維和/或三維結構之間的相互作用介導。在一些實施方式中，適體與靶標的結合不僅僅基于適體的基本序列，還取決于適體和/或靶標的三維結構。在一些實施方式中，適體通過watson-crick互補堿基配對與其靶標結合，所述watson-crick堿基配對被破壞堿基配對的結構(例如，發夾環)阻礙。
[0181]
在一些實施方式中，核酸靶向部分為spiegelmers(pct公布wo 98/08856,wo 02/100442和wo 06/117217)。總體而言，spiegelmers為合成的鏡像核酸，其可特異性結合靶標(即，鏡像適體)。spiegelmers通過如下結構特征表征：所述結構特征使得它們不易受外切-核酸酶和內切-核酸酶的影響。
[0182]
本領域普通技術人員會意識到的是，根據本發明可使用任何能夠特異性結合靶標的核酸靶向部分(例如，適體或spiegelmers)。在一些實施方式中，根據本發明待使用的核酸靶向部分可靶定與疾病、失調和/或病癥有關的標記物。在一些實施方式中，根據本發明待使用的核酸靶向部分可靶定癌相關靶標。在一些實施方式中，根據本發明待使用的核酸靶向部分可靶定腫瘤標記物。使用根據本發明的核酸靶向部分可靶定任何類型的癌癥標記物和/或任何腫瘤標記物。舉例而言，核酸靶向部分可靶定與前列腺癌、肺癌、乳腺癌、直腸結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、骨癌、食管癌、肝癌、胃癌、腦腫瘤、皮膚黑素瘤和/或白血病有關的標記物。
[0183]
本發明的核酸(包括核酸靶向部分和/或待遞送的功能性rna，例如，rnai-誘導實體，核酶，trna，等等，下面進一步詳細描述)可根據任何可獲得的技術制備，包括但不限于：化學合成、酶合成、較長的前體的酶裂解或化學裂解，等等。合成rna的方法為本領域已知的(參見例如，gait,m.j.(編輯)oligonucleotide synthesis:a practical approach,oxford[oxfordshire],washington,d.c.:irl press,1984；和herdewijn,p.(編輯)oligonucleotide synthesis:methods and applications,methods in molecular biology,v.288(clifton,n.j.)totowa,n.j.:humana press,2005)。
[0184]
形成核酸靶向部分的核酸可包含天然生成的核苷，修飾的核苷，具有在一個或一個以上核苷之間插入的烴連接體(例如，亞烷基)或聚醚連接體(例如，peg連接體)的天然生成的核苷，具有在一個或一個以上核苷之間插入的烴連接體或peg連接體的修飾的核苷，或它們的組合。在一些實施方式中，核酸靶向部分的核苷酸或修飾的核苷酸可被烴連接體或聚醚連接體取代，只要核酸靶向部分的結合親合力和選擇性基本不會由于取代(例如，核酸靶向部分對靶標的解離常數不應大于約1
×
10-3
m)而降低。
[0185]
本領域普通技術人員已知，根據本發明的核酸可包含天然生成的核酸中發現的全部類型的核苷酸或者可包括一種或一種以上核苷酸類似物或具有與天然生成的核酸的結構不同的結構。美國專利第6,403,779號、第6,399,754號、第6,225,460號、第6,127,533號、第6,031,086號、第6,005,087號、第5,977,089號，這些美國專利中的參考文獻公開了多種不同的具體核苷類似物和可使用的修飾。參見crooke,s.(編輯)antisense drug technology:principles,strategies,and applications(第一版),marcel dekker；isbn:0824705661；第一版(2001)以及其中的參考文獻。例如，2
’?
修飾包括鹵代、烷氧基和烯丙氧基。在一些實施方式中，2
’?
oh基團被選自下列的基團取代：h，or，r，鹵素，sh，sr，nh2，nhr，nr2或cn，其中，r為c1-c6烷基，烯基，或炔基，并且鹵素為f，cl，br或i。修飾的連接鍵的實例包括硫代磷酸酯和5
’?
n-亞磷酰胺連接鍵。
[0186]
根據本發明可使用包含多種不同的核苷酸類似物、修飾的骨架或非天然生成的核苷間連接鍵的核酸。本發明的核酸可包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷)或修飾的核苷。修飾的核苷酸的實例包括堿基修飾的核苷(例如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌核苷、異鳥苷、水粉葷素(nebularine)、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脫氮-5-氮雜胞苷、2
’?
脫氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿苷、5-溴代胞苷、5-碘代尿苷、肌核苷、6-氮尿苷、6-氯代嘌呤、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氮雜腺苷、8-疊氮腺苷、苯并咪唑、m1-甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2-氨基-6-氯代嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴代尿苷、5-氟代尿苷、5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧腺苷、8-氧鳥苷、o(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)，化學或生物修飾的堿基(例如，甲基化的堿基)，修飾的糖類(例如，2
’?
氟代核糖、2
’?
氨基核糖、2
’?
疊氮核糖、2
’?
o-甲基核糖、l-對映異構體核苷阿糖和己糖)，修飾的磷酸酯基團(例如，硫代磷酸酯和5
’?
n-亞磷酰胺連接鍵)以及它們的組合。用于核酸的化學合成的天然核苷酸單體和修飾的核苷酸單體易于獲得。在一些情況下，含有這些修飾的核酸相對于僅由天然生成的核苷酸構成的核酸表現出改善的性質。在一些實施方式中，本文所述的核酸修飾被用于降低和/或防止核酸酶(例如，核酸外切酶，核酸內切酶，等等)消化。例如，核酸的結構可通過在一條鏈或兩條鏈的3’端包括核苷酸類似物以降低消化來穩定。
[0187]
修飾的核酸不需要沿著分子的全長進行一致性修飾。不同的核苷酸修飾和/或骨架結構可存在于核酸的各個不同位置。本領域普通技術人員可理解的是，核苷酸類似物或其他修飾可位于使核酸的功能基本不受影響的核酸的任何位置。舉例而言，修飾可位于使核酸靶向部分特異性結合靶標的能力基本不受影響的核酸靶向部分的任何位置。修飾的區域可位于一條鏈或兩條鏈的5’端和/或3’端。例如，已使用如下修飾的核酸靶向部分：位于該修飾的核酸靶向部分中的兩條鏈中的任一條鏈的5’端和/或3’端處的大約1至5個殘基為核苷酸類似物和/或具有骨架修飾。所述修飾可為5’或3’末端修飾。一條或兩條核酸鏈可包含至少50％未修飾的核苷酸，至少80％未修飾的核苷酸，至少90％未修飾的核苷酸或100％未修飾的核苷酸。
[0188]
例如，根據本發明的核酸可包含對糖類、核苷或核苷間連接鍵的修飾，例如，美國專利申請公開第2003/0175950號,第2004/0192626號,第2004/0092470號,第2005/0020525號以及第2005/0032733號中描述的那些。本發明包括具有本文所述的修飾中的任何一種或
一種以上的任何核酸的應用。例如，已報道了多種末端偶聯物(例如，脂質(例如，膽固醇)、石膽酸、月桂酸(aluric acid)、長支鏈烷基)改善細胞攝取。例如，可使用本領域已知的任何合適的測試方法檢測類似物和修飾，從而選擇使劑或診斷劑的遞送得以改善、使核酸的靶向部分與靶標的特異性結合得以改善等等的那些類似物和修飾。在一些實施方式中，根據本發明的核酸可包括一個或一個以上非天然核苷連接鍵。在一些實施方式中，一個或一個以上位于核酸靶向部分的3’端、5’端或3’端和5’端這兩端的內在核苷酸被倒轉生成諸如3
’?3’
連接鍵或5
’?5’
連接鍵之類的連接鍵。
[0189]
在一些實施方式中，根據本發明的核酸不是合成的，其為已從其天然環境中分離出來的天然生成的實體。
[0190]
可使用任何方法來設計新的核酸靶向部分(請參見例如下列美國專利：6,716,583；6,465,189；6,482,594；6,458,543；6,458,539；6,376,190；6,344,318；6,242,246；6,184,364；6,001,577；5,958,691；5,874,218；5,853,984；5,843,732；5,843,653；5,817,785；5,789,163；5,763,177；5,696,249；5,660,985；5,595,877；5,567,588和5,270,163以及下列美國專利申請公開：2005/0069910,2004/0072234,2004/0043923,2003/0087301,2003/0054360和2002/0064780)。本發明提供一種用于設計新的核酸靶向部分的方法。本發明還提供一種用于從候選核酸靶向部分的混合物中分離或識別新的核酸靶向部分的方法。
[0191]
可設計和/或識別與蛋白質、碳水化合物、脂質和/或核酸結合的核酸靶向部分。在一些實施方式中，核酸靶向部分可被設計和/或識別為在與蛋白質和/或其特征部分結合的本發明的復合物中使用，所述蛋白質和/或其特征部分例如，腫瘤標記物、整合素、細胞表面受體、跨膜蛋白、細胞間蛋白質、離子通道、膜轉運蛋白、酶、抗體、嵌合蛋白，等等。在一些實施方式中，核酸靶向部分可被設計和/或識別為在與碳水化合物和/或其特征部分結合的本發明的復合物中使用，所述碳水化合物和/或其特征部分例如，糖蛋白、糖類(例如，單糖、二糖和多糖)、多糖包被(即，大多數真核細胞的外表面上的碳水化合物富集的外周區域)，等等。在一些實施方式中，核酸靶向部分可被設計和/或識別為在與脂質和/或其特征部分結合的本發明的復合物中使用，所述脂質和/或其特征部分例如，油、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、甘油酯、激素、類固醇(例如，膽固醇、膽汁酸)、維生素(例如，維生素e)、磷脂、神經鞘脂、脂蛋白，等等。在一些實施方式中，核酸靶向部分可被設計和/或識別為在與核酸和/或其特征部分結合的本發明的復合物中使用，所述核酸和/或其特征部分例如，dna核酸、rna核酸、修飾的dna核酸、修飾的rna核酸和包括dna、rna、修飾的dna和修飾的rna的任何組合的核酸，等等。
[0192]
可使用任何可獲得的方法設計和/識別核酸靶向部分(例如，適體或spiegelmer)。在一些實施方式中，核酸靶向部分通過從候選的核酸混合物中識別核酸靶向部分來設計和/或識別。指數富集配體系統進化(selex)或其改良方法為從候選的核酸混合物中識別與靶標結合的核酸靶向部分的常用方法。
[0193]
選擇性結合任何靶標的核酸靶向部分可通過selex方法或其改良方法分離，條件是所述靶標可用作selex方法中的靶標。
[0194]
b.活化部分
[0195]
總體而言，本發明的化合物包含活化部分。
[0196]
本文中的“活化部分”是指能夠刺激或增強個體的免疫系統或腫瘤細胞的分子或
tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neck cancer.cancer res 2003；63:6478-6487.zou wp,machelon v,coulomb-l'hermin a,等人，stromal-derived factor-1in human tumors recruits and alters the function of plasmacytoid precursor dendritic cells.nat med 2001；7:1339-1346)和由腫瘤細胞分泌的因子抑制dc成熟(gabrilovich di,corak j,ciernik if等人，decreased antigen presentation by dendritic cells in patients with breast cancer.clin cancer res 1997；3:483-490.bell d,chomarat p,broyles d等人，in breast carcinoma tissue,immature dendritic cells reside within the tumor,whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas.j exp med 1999；190:1417-1425.menetrier-caux c,montmain g,dieu mc等人，inhibition of the differentiation of dendritic cells from cd34(+)progenitors by tumor cells:role of interleukin-6and macrophage colony-stimulating factor.blood 1998；92:4778-4791)。這些未成熟的dc細胞無法在提高抗腫瘤免疫方面發揮作用。相比之下，腫瘤微環境中的dc通過抑制抗腫瘤免疫和促進血管生成而促進腫瘤生長。有證據表明toll樣受體7激動劑咪喹莫特和toll樣受體9激動劑cpg藥物可刺激腫瘤微環境中的pdc，從而抑制腫瘤發展(dummer r,urosevic m,kempf w等人，imiquimod in basal cell carcinoma:how does it work？br j dermatol 2003；149:57-58.miller rl,gerster jf,owens ml等人，imiquimod applied topically:a novel immune response modifier and new class of drug.int j immunopharmacol 1999；21:1-14.hofmann ma,kors c,audring h等人，phase 1evaluation of intralesionally injected tlr9-agonist pf-3512676in patients with basal cell carcinoma or metastatic melanoma.j immunother 2008；31:520-527)。
[0204]
在一些實施方式中，人樹突細胞為漿細胞樣樹突細胞。
[0205]
在一些實施方式中，人樹突細胞為髓樣樹突細胞。
[0206]
在一些實施方式中，活化部分能夠特異性結合人tlr7或人tlr8，由此能夠活化pdc或mdc。
[0207]
在一些實施方式中，活化部分能夠特異性結合人tlr7和人tlr8這兩者，由此能夠活化pdc和mdc這兩者。pdc選擇性表達內涵體toll樣受體(tlr)7和tlr9，而mdc選擇性表達tlr8。bao m,liu yj.regulation of tlr7/9signaling in plasmacytoid dendritic cells,protein cel.2013jan；4(1):40-52.h
é
mont c,neel a,heslan m,braudeau c,josien r.human blood mdc subsets exhibit distinct tlr repertoire and responsiveness.j leukoc biol.2013 apr；93(4):599-609。
[0208]
自然殺傷細胞(nk細胞)
[0209]
在一些實施方式中，活化部分能夠活化自然殺傷細胞(nk細胞)，所述自然殺傷細胞優選地為人nk細胞。
[0210]
自然殺傷(nk)細胞為一類細胞毒性淋巴細胞，其構成免疫系統的主要成分。nk細胞為由cd56或cd16的表達和t細胞受體(cd3)的缺乏界定的外周血液淋巴細胞的一個亞型。所述自然殺傷細胞在不引發(priming)mhc非限制性方式的條件下識別并殺傷轉化的細胞系。nk細胞在抑制腫瘤和防止細胞受到病毒感染方面發揮重要作用。nk細胞識別靶細胞并
evasion of immune surveillance.cancer res.2005；65(12):5009
–
5014)。tlr3在人乳腺癌細胞中表達(salaun b,coste i,rissoan mc,lebecque sj,renno t.tlr3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells.j immunol.2006；176(8):4894
–
4901)，肝癌和胃癌細胞表達tlr2和tlr4(huang b等人，listeria monocytogenes promotes tumor growth via tumor cell toll-like receptor 2signaling.cancer res.2007；67(9):4346
–
4352)，并且tlr9(droemann d等人,human lung cancer cells express functionally active toll-like receptor 9.respir res.2005；6:1)和tlr4(he w,liu q,wang l,chen w,li n,cao x.tlr4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.mol immunol.2007；44(11):2850
–
2859)通過人肺癌細胞表達。在人肺癌腫瘤細胞中發現tlr7和tlr8(cherfils-vicini j,platonova s,gillard m,laurans l,validire p,caliandro r,magdeleinat p,mami-chouaib f,dieu-nosjean mc,fridman wh,damotte d,saut
è
s-fridman c,cremer i.j.clin invest.2010；120(4):1285
–
1297)。
[0219]
對腫瘤細胞的作用可為各種各樣的，例如，在人乳腺癌和黑素瘤細胞中，通過poly i:c刺激tlr3直接觸發腫瘤細胞凋亡(salaun b,coste i,rissoan mc,lebecque sj,renno t.tlr3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells.j immunol.2006；176(8):4894
–
4901.,salaun b,lebecque s,matikainen s,rimoldi d,romero p.toll-like receptor 3expressed by melanoma cells as a target for therapy？clin cancer res.2007；13(15pt 1):4565
–
4574)。另一方面，人肺癌細胞表達具有功能活性的toll-樣受體9并且通過cpg-odn對tlr-9表達細胞系a549和hela的刺激表現出抗細胞凋亡作用。盡管如此，累積的數據表示出tlr很好地與癌細胞結合并且可直接或間接地影響癌細胞。
[0220]
活化部分的化學組成
[0221]
總體而言，本發明的活化部分包含蛋白質、抗體、核酸、小分子或配體。
[0222]
在一些實施方式中，am能夠特異性結合人tlr7和/或人tlr8。
[0223]
在一些實施方式中，活化部分包含：(a)單鏈rna(ssrna)，優選地為orn02，orn06，sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,或poly(dt)，或者(b)配體類似物，優選地為cl075,cl097,cl264,cl307，gardiquimod、洛索立賓(loxoribine)、咪喹莫特或瑞喹莫德(resiquimod)。
[0224]
在一些實施方式中，活化部分包含tlr配體(tlrl)、nod-樣受體配體、rig-樣受體配體、clr配體、cds配體或炎性體誘導物。
[0225]
在一些實施方式中，活化部分包含一種或一種以上選自以下的tlr的配體：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9和tlr10。
[0226]
tlr為感應微生物產物和/或啟動獲得性免疫反應的蛋白質家族。tlr活化樹突細胞(dc)。tlr為含有富含亮氨酸的重復單元胞外結構域、跨膜結構域和細胞內tir(toll/白介素受體)結構域的保守跨膜分子。tlr識別微生物中的不同結構，通常稱為“pamp”(病原體相關分子模式)。與tlr結合的配體引起細胞內信號通路的級聯反應，該級聯反應誘導參與炎癥和免疫的因子的生成。
[0227]
可用于這些受體的示例性的激動劑包括但不限于：脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母
聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌孔蛋白、鞭毛蛋白、profiilin、galactoceramide、胞壁酰二肽、giucopyranosyl脂質a(gla)和瑞喹莫德(r848)。肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸為革蘭氏陽性細胞壁成分。脂多糖由大多數細菌表達。鞭毛蛋白為細菌鞭毛的結構成分，所述細菌鞭毛的結構成分由病原細菌和共生細菌分泌。半乳糖苷神經酰胺(galactosylceramide(α-galcer))為天然殺傷t(nkt)細胞的活化劑。胞壁酰二肽為所有細菌共有的生物活性肽聚糖基序。這些激動劑通過toll-樣受體介導先天性免疫活化。激動劑與其同源受體的特異性結合通常根據親和性表達。本發明的配體可以約104m-1
至約108m-1
的親合力結合。親合力被計算為kd＝k
off
/k
on
(k
off
為解離速率常數，k
on
為結合速率常數，kd為平衡常數)。可使用單個激動劑或多個激動劑。
[0228]
已發現了人體中至少八種tlr。在細胞表面表達的tlr包括tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8或tlr7/tlr8,tlr9和tlr10，并且tlr通過er腔室表達。人樹突細胞亞類可基于不同的tlr表達模式來識別。例如，髓樣dc或“常規”dc亞類(mdc)當被刺激時表達tlr2至tlr8，并且產生一連串活化標記物(例如，cd80,cd86,i類和ii類mhc,ccr7)，促炎細胞因子和趨化因子。這種刺激和所產生的表達的結果為抗原特異性cd4+t細胞和抗原特異性cd8+t細胞引發。這些dc獲得提高的攝取抗原的能力并且以合適的形式將抗原呈遞于t細胞。相反，dc的漿細胞樣亞類(pdc)在活化后僅僅表達tlr7和tlr9，由此活化nk細胞和t細胞。不受任何特定理論的限制，死亡的腫瘤細胞可對dc功能產生不良影響，假設通過tlr激動劑活化dc在癌癥的免疫療法中對于引發抗腫瘤免疫有益。使用放療和化療成功乳腺癌也說明了需要tlr4活化。
[0229]
本領域已知的且在本發明中有用的tlr激動劑包括但不限于：pam3cys(tlr-1/2激動劑)，細胞壁成分產物(lam,lm,lps,lta,lta)(tlr-2激動劑)，malp2(tlr-2激動劑)，pam2cys(tlr-2激動劑)，fsl(tlr-2激動劑)，酵母聚糖(tlr-2激動劑)，pgn(tlr-2激動劑)，polyribosinic，polyribocytidic acid(poly i:c)(tlr-3激動劑)，聚腺苷-聚尿苷酸(polyau，tlr-3激動劑)，通過聚-l-賴氨酸和羧甲基纖維素穩定的聚肌苷-聚胞苷酸(tlr-3激動劑)，單磷酰基脂質a(mpl，tlr-4激動劑)，lps(tlr-4激動劑)，細菌鞭毛蛋白(tlr-5激動劑)，fla(tlr-5激動劑)，orn02(tlr-7/8激動劑)，orn06(tlr-7/8激動劑)，sspoly(u)(tlr-7/8激動劑)，ssrna40(tlr-7/8激動劑)，ssrna41(tlr-7/8激動劑)，ssrna-dr(tlr-7/8激動劑)，poly(dt)(tlr-7/8激動劑)，cl075(tlr-7/8激動劑)，cl097(tlr-7/8激動劑)，cl264(tlr-7/8激動劑)，cl307(tlr-7/8激動劑)，gardiquimod(tlr-7/8激動劑)，洛索立賓(tlr-7/8激動劑)，咪喹莫特(tlr-7/8激動劑)，瑞喹莫德(tlr-7/8激動劑)和odn1585(tlr-9激動劑)，odn1668(tlr-9激動劑)，odn1826(tlr-9激動劑)，odn2006(tlr-9激動劑)，odn2007(tlr-9激動劑)，odn2216(tlr-9激動劑)，odn2336(tlr-9激動劑)，odn2395(tlr-9激動劑)，odn m362(tlr-9激動劑)。
[0230]
在一些實施方式中，活化部分包含：
[0231]
(i)tlr2的配體，其選自：(a)熱殺死的細菌產物，優選地為hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)細胞壁成分產物，優選地為lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；
[0232]
(ii)tlr3的配體，其選自：poly(i:c)和poly(a:u)；
[0233]
(iii)tlr4的配體，其選自：lps和mpla；
[0234]
(iv)tlr5的配體，其選自：fla和鞭毛蛋白；
[0235]
(v)tlr7，tlr 8，或tlr 7和tlr的配體，其選自：orn02(tlr8),orn06(tlr8),sspoly(u)(tlr8),ssrna40(tlr8),ssrna41(tlr8),ssrna-dr(tlr8),poly(dt)(tlr7/8),cl075(tlr7/8),cl097(tlr7/8),cl264(tlr7),cl307(tlr7),gardiquimod(tlr7),洛索立賓(tlr7),咪喹莫特(tlr7/8),和瑞喹莫德(tlr7/8)；
[0236]
(vi)tlr9的配體，其選自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；
[0237]
(vii)tlr10的配體；
[0238]
(viii)核苷酸-寡聚結構域(nod)樣配體，其選自：nod1激動劑(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激動劑(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羥乙酸基-mdp)和nod1/nod2激動劑(m-tridap,pgn)；
[0239]
(ix)一種或一種以上rig-i樣受體(rlr)的配體，其選自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；
[0240]
(x)一種或一種以上c型植物凝集素受體(clr)的配體，其選自：凝膠多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山崳酸鹽；
[0241]
(xi)一種或一種以上細胞溶質dna傳感器(cds)的配體，其選自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；以及
[0242]
(xii)炎性體誘導物，其選自：(a)nlrp3炎性體蛋白質復合物，優選地為明礬晶體，atp，cppd晶體，hermozoin，msu晶體，納米sio2，尼日利亞菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性體蛋白質復合物，優選地為poly(da:dt)。
[0243]
在一些實施方式中，活化部分包括imo2134,imo205,mgn-1703,mgn-1704,阿托莫得(agatolimod),sd-101,qax-935,dims0150,pollinex quattro,om-174,eritoran,tak-242,ni-0101，i型干擾素,ii型干擾素,iii型干擾素,il-12,il-23,il-18,il-7或il-15。
[0244]
在一些實施方式中，活化部分能夠特異性結合人tlr7和/或人tlr8，優選地特異性結合tlr7和tlr8這兩者(例如，瑞喹莫德(r848))，由此活化部分能夠活化pdc和mdc這兩者。tlr7和tlr8為系統發育和結構相關的。tlr7由人pdc和b細胞選擇性表達。tlr8主要由mdc、單核細胞、巨噬細胞和骨髓抑制細胞表達。tlr7特異性激動劑活化漿細胞樣dc(pdc)，從而生成大量1型ifn并且表達高水平的共刺激分子，所述共刺激分子促進t細胞、nk細胞、b細胞和mdc的活化。tlr8特異性激動劑活化髓樣dc、單核細胞、巨噬細胞或骨髓衍生的抑制細胞，從而生成大量1型ifn、il-12和il-23，并且表達高水平的i類mhc、ii類mhc和共刺激分子，所述i類mhc、ii類mhc和共刺激分子促進抗原特異性cd4和cd8+t細胞的活化。
[0245]
通過tlr活化人免疫細胞的其他部分或分子可由tlr受體細胞系識別，例如，來自invivogen的293/tlr受體細胞。
[0246]
可活化tlr7和/或tlr8的其他部分或分子以及這些其他部分刺激pdc生成1型ifn的能力、刺激mdc生成1型ifn和il-12的能力、上調cd80和cd86的表達的能力可使用來自invivogen的293/tlr受體細胞來識別。
[0247]
能夠通過1型ifn和共刺激分子(例如，由活化的pdc和/或mdc表達的gitr-配體)活化nk細胞的活化部分可通過總外周血單核細胞檢測中nk細胞增殖和活化標記物cd69的表
達來識別。
[0248]
能夠活化腫瘤細胞以使其經歷細胞死亡并生成諸如1型ifn、il-1a/b、tnf或il-6之類的細胞因子的活化部分可使用本領域已知的方法來識別。
[0249]
能夠活化dc細胞、單核細胞、巨噬細胞、骨髓抑制細胞、b細胞、nk細胞或腫瘤細胞的其他活化部分或分子可使用本領域已知的方法識別。
[0250]
在一些實施方式中，當靶向部分包括抗體(或其片段)或適體時，活化部分不包括cpg寡核苷酸。
[0251]
在一些實施方式中，尤其是當靶向部分包括抗體或其片段或者適體時，活化部分不包括劑，例如，化療劑或毒素(例如，抗體藥物偶聯物中通常使用的毒素)。因此，一般而言，本發明的化合物不包括抗體藥物偶聯物(adc)或抗體-cpg偶聯物。
[0252]
c.連接體
[0253]
總體而言，本發明的化合物包含連接體，所述連接體將靶向部分和活化部分連接。然而，一些化合物不含連接體，活化部分和靶向部分直接連接。
[0254]
本文中的“連接體”是指使第一分子與第二分子通過化學鍵連接的部分。在本發明的連接體中，可割斷連接，從而釋放第一和/或第二分子的生物活性形式。連接體的優選實例為包含在中性ph條件下穩定但在較低ph條件下易于發生裂解的化學鍵的部分。具體而言，優選的連接體的實例為包含在ph為7至8的條件下穩定但在ph為4至6的條件下易于裂解的化學鍵的部分。連接體的另一實例為包含在存在酶的條件下易于裂解的化學鍵的部分。這些對酶敏感的連接體的優選實例為肽，所述肽包含內涵體肽酶的識別序列。連接體的另一實例為對氧化還原電位敏感的連接體，該連接體在低還原電位(例如，低濃度的硫醇或谷胱甘肽)條件下穩定但在高還原電位(例如，高濃度的硫醇或谷胱甘肽)條件下裂解。這些對氧化還原電位敏感的連接體的優選實例包括二硫化物和次磺酰胺。具體而言，優選的實例包括取代的芳基-烷基二硫化物，其中，芳基被有空間需求的且吸電子或給電子的取代基取代，從而控制趨于與硫醇反應的二硫鍵的敏感性。連接體的另一實例為包含在暴露于輻射之后易于裂解的化學鍵的部分。這些對輻射敏感的連接體的優選實例為2-硝基芐基醚，其在暴露于光之后裂解。具體而言，這些連接體的優選實例為如下部分：在連接鍵被割斷之前該部分掩蓋兩個連接的分子中的一個的生物活性。
[0255]
在一些實施方式中，本發明的化合物包含選自如下基團的連接體：肼基團、多肽、二硫化物基團和硫醚基團。
[0256]
本文中的“肼基團”或“肼連接體”或“自環化肼連接體”是指在改變條件(例如，ph改變)之后可發生環化反應并形成一個或一個以上環的連接體部分。當連接時，肼基團被轉化為腙。這種連接可通過例如在l4部分與酮基團反應而發生。因此，術語肼連接體也可用于描述本發明的連接體，因為這種向腙的轉化發生在連接之后。
[0257]
本文中的“五元肼連接體”是指含有肼的分子部分，該部分在條件發生改變(例如，ph發生改變)之后會進行環化反應并形成一個或一個以上五元環。可選地，該五元連接體可被類似地描述為五元肼連接體。
[0258]
本文中的“六元肼連接體”是指含有肼的分子部分，該部分在條件發生改變(例如，ph發生改變)之后會進行環化反應并形成一個或一個以上六元環。該六元連接體可被類似地描述為六元肼連接體。
[0259]
本文中的“環化反應”是指肽、肼或二硫化物連接體的環化，該“環化反應”表示連接體環化形成環并且啟動藥物配體復合物的分離。環化速率可異地測量并且當至少90％、95％或100％的產物形成時完成環化。
[0260]
在一些實施方式中，本發明的化合物包含位于靶向部分和活化部分之間的連接體區域，并且所述連接體可被存在于細胞內環境(例如，溶酶體或內涵體或小凹內)中的裂解劑裂解。連接體可為例如，肽基連接體，該肽基連接體由細胞內肽酶或蛋白酶(包括但不限于：溶酶體蛋白酶或內涵體蛋白酶)裂解。通常，肽基連接體的長度為至少兩個氨基酸的長度或至少三個氨基酸的長度。裂解劑可包括組織蛋白酶b、組織蛋白酶d和纖溶酶，已知組織蛋白酶b、組織蛋白酶d和纖溶酶均可水解二肽藥物衍生物，導致靶細胞內部的活物釋放(參見例如，dubowchik and walker,1999,pharm.therapeutics 83:67-123)。最典型的連接體為肽基連接體，其可由存在于靶細胞或組織中的酶裂解。例如，可使用可由硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-b裂解的肽基連接體(例如，phe-leu或(gly-phe-leu-gly)連接體)，所述硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-b在癌組織中高表達。其他這類連接體例如在美國專利第6,214,345號中描述。在一些實施方式中，可由細胞內蛋白酶裂解的肽基連接體為val-cit連接體或phe-lys連接體(參見例如，美國專利第6,214,345號，該美國專利描述了帶有val-cit連接體的阿霉素的合成)。使用細胞內蛋白水解釋放劑的一個優勢為所述劑通常在偶聯時被弱化并且偶聯物的血清穩定性通常較高。
[0261]
在一些實施方式中，可裂解的連接體為ph敏感的，即對某一ph值條件敏感而發生水解。通常，ph敏感的連接體在酸性條件下可水解。例如，可使用在溶酶體中可水解的酸不穩定連接體(例如，腙、縮氨基脲、硫代縮氨基脲、順式烏頭酰胺、原酸酯、縮醛、縮酮，等等)，參見例如，美國專利第5,122,368號，第5,824,805號，第5,622,929號，dubowchik and walker,1999,pharm.therapeutics 83:67-123；neville等人,1989,biol.chem.264:14653-14661。這些連接體在中性ph條件下相對穩定，例如，在血液中的那些連接體，但是在低于5.5或5.0的ph條件(大約為溶酶體的ph)下不穩定。在一些實施方式中，可水解的連接體為硫醚連接體(例如，通過酰基腙化學鍵與劑連接的硫醚，參見例如，美國專利第5,622,929號)。
[0262]
在其他實施方式中，連接體為在還原性條件下可裂解的(例如，二硫化物連接體)。本領域已知多種二硫化物連接體，包括例如，可使用sata(n-琥珀酰亞胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯)，spdp(n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)，spdb(n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亞胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)，spdb和smpt(參見例如，thorpe等人,1987,cancer res.47:5924-5931；wawrzynczak等人,in immunoconjugates:antibody conjugates in radioimagery and therapy of cancer(c.w.vogel編輯),oxford u.出版,1987.還參見美國專利第4,880,935號)形成的那些連接體。
[0263]
在其他具體實施方式中，連接體為丙二酸酯連接體(johnson等人,1995,anticancer res.15:1387-93)，馬來酰亞胺苯甲酰基連接體(lau等人,1995,bioorg-med-chem.3(10):1299-1304)或3
’?
n-酰胺類似物(lau等人,1995,bioorg-med-chem.3(10):1305-12)。
[0264]
通常，連接體對細胞外環境基本不敏感。本文在連接體的部分使用的“對細胞外環
境基本不敏感”是指在本發明的化合物樣品中，當本發明的化合物存在于細胞外環境(例如，血漿中)時，不超過約20％的連接體裂解，典型地不超過約15％的連接體裂解，更加典型地不超過約10％連接體裂解，甚至更加典型地不超過約5％的連接體裂解，不超過約3％的連接體裂解，或者不超過約1％的連接體裂解。例如，可通過將(a)本發明的化合物(“化合物樣品”)和(b)等摩爾量的未偶聯的抗體或劑(“對照樣品”)獨立地與血漿一同孵育一段預定的時間段(例如，2小時、4小時、8小時、16小時或24小時)并隨后比較存在于化合物樣品中的未偶聯的抗體或劑的量和存在于對照樣品中的未偶聯的抗體或劑的量(例如通過高效液相譜測量)來測定連接體是否對細胞外環境基本不敏感。
[0265]
在其他不相互排斥的實施方式中，連接體促進細胞內在化。在一些實施方式中，當連接體偶聯于活化部分時，連接體促進細胞內在化。在其他實施方式中，當連接體偶聯于靶向部分和活化部分這兩者時，連接體促進細胞內在化。
[0266]
可在本發明的組合物和方法中使用的多種連接體在wo2004010957(名稱為“drug conjugates and their use for treating cancer,an autoimmune disease or an infectious disease”)以及us20120141509a1和us20120288512a1(其公開的內容通過引用并入本文)中描述。
[0267]
在一些實施方式中，連接體單元具有如下通式：
[0268]-ta-ww-yy-[0269]
其中，-t-為支架單元，a為0或1，-w-分別獨立地為氨基酸單元，w獨立地為2至12的整數，-y-為間隔單元，y為0、1或2。
[0270]
支架單元
[0271]
當存在支架單元(-t-)時，該支架單元將靶向部分連接至氨基酸單元(-w-)。可天然地或通過化學操作存在于靶向部分(例如，抗體)上的有用的官能團包括但不限于：巰基、氨基、羥基、碳水化合物的異頭羥基和羧基。合適的官能團為巰基和氨基。巰基可通過還原抗體的分子內二硫鍵生成。可選地，巰基可通過抗體的賴氨酸基團的氨基與2-亞氨基硫雜環戊烷(traut試劑)或其他巰基生成試劑的反應生成。在一些實施方式中，抗體為重組抗體并且被設計為帶有一個或一個以上賴氨酸。在其他實施方式中，重組抗體被設計為帶有額外的巰基基團，例如，額外的半胱氨酸。
[0272]
在一些實施方式中，支架單元與抗體的硫原子形成化學鍵。所述硫原子可來源于還原的抗體(a)的巰基基團(-sh)。這些實施方式的代表性的支架單元在通式(iia)和(iib)的方括號中描述，其中，a-、-w-、-y-、-d、w和y為如上所定義的，并且r1選自：-c
1-c
10
亞烷基-、-c
3-c
8-碳環-、-o-(c
1-c8烷基)-、-亞芳基-、-c
1-c
10
亞烷基-亞芳基-、-亞芳基-c
1-c
10-亞烷基-、-c
1-c
10-亞烷基-(c
3-c8碳環)-、-(c
3-c8碳環)-c
1-c
10
亞烷基-、-c
3-c
8-雜環-、-c
1-c
10-亞烷基-(c
3-c8雜環)-、-(c
3-c8雜環)-c
1-c
10
亞烷基-、-(ch2ch2o)r-和-(ch2ch2o)r-ch
2-，并且r為1至10的整數。
[0273][0274]
示例性的支架單元為r1為-(ch2)
5-時的通式(iia)的支架單元：
[0275][0276]
另一示例性的支架單元為r1為-(ch2ch2o)r-ch
2-并且r為2時的通式(iia)的支架單元：
[0277][0278]
另一示例性的支架單元為r1為-(ch2)
5-時的通式(iib)的支架單元：
[0279][0280]
在一些其他具體實施方式中，支架單元通過抗體單元的硫原子和支架單元的硫原子之間的二硫鍵連接至抗體單元(a)。本實施方式的代表性的支架單元在通式(iii)的方括號中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y是如上所定義的。
[0281][0282]
在其他具體實施方式中，支架的反應性基團包含可與抗體的氨基基團反應的反應位點。氨基基團可為精氨酸或賴氨酸。合適的胺反應位點包括但不限于：活化的酯(例如，琥珀酰亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟代苯基酯)，酸酐、酰氯、磺酰氯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。這些實施方式的代表性的支架單元在通式(iva)和(ivb)的方括號中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y為如上所述的。
[0283][0284]
另一方面，支架的反應性官能團包含與可存在于抗體上的修飾的碳水化合物基團反應的反應位點。在一些實施方式中，抗體通過酶的方式被糖基化，從而生成碳水化合物基團。碳水化合物可被諸如高碘酸鈉之類的試劑溫和地氧化，得到的氧化的碳水化合物的羰基單元可與含有諸如酰肼、肟、反應性胺、肼、硫代氨基脲、肼羧酸酯和芳基酰肼(例如kaneko等人,1991,bioconjugate chem 2:133-41中所描述的那些)之類的官能團的支架縮合。本實施方式的代表性的支架單元在通式(va)至(vc)的方括號中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y為如上所述的。
[0285][0286]
氨基酸單元
[0287]
如果間隔單元存在的話，氨基酸單元(-w-)將支架單元(-t-)連接至間隔單元(-y-)，如果間隔單元不存在的話，氨基酸單元將支架單元連接至細胞毒性劑或細胞抑制劑(活化部分，d)。-ww-為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。每個-w-單元獨立地具有如下方括號中所述的通式，并且w為2至12的整數。
[0288][0289]
其中，r2為氫、甲基、異丙基、異丁基、仲丁基、芐基、對羥基芐基、—ch2oh、—ch(oh)ch3、—ch2ch2sch3、—ch2conh2、—ch2cooh、—ch2ch2conh2、—ch2ch2cooh、—(ch2)3nhc(
═
nh)nh2、—(ch2)3nh2、—(ch2)3nhcoch3、—(ch2)3nhcho、—(ch2)4nhc(
═
nh)nh2,—(ch2)4nh2、—(ch2)4nhcoch3、—(ch2)4nhcho、—(ch2)3nhconh2、—(ch2)4nhconh2、—ch2ch2ch(oh)ch2nh2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基、
[0290]
連接體單元的氨基酸單元可通過酶(包括但不限于：腫瘤相關蛋白酶)的方式被酶裂解，從而釋放出活化部分(-d)，釋放后該活化部分在體內被質子化，從而產生活化分子(d)。
[0291]
示例性的ww單元由通式(vi)至(viii)表示：
[0292][0293]
其中，r3和r4如下表所示：
[0294]
[0295][0296][0297]
其中，r3、r4和r5如下表所示：
[0298][0299][0300]
其中，r3、r4、r5和r6如下表所示：
[0301][0302]
合適的氨基酸單元包括但不限于：通式(vi)單元，其中，r3為芐基，r4為-(ch2)4nh2，r3為異丙基并且r4為-(ch2)4nh2，或者r3為異丙基并且r4為-(ch2)3nhconh2。另一合適的氨基酸單元為通式(vii)單元，其中，r3為芐基、r4為芐基并且r5為-(ch2)4nh2。-ww-單元可在其選擇性方面被設計并優化為通過特定的腫瘤相關蛋白酶進行酶裂解。合適的-ww-單元為那些通過蛋白酶(組織蛋白酶b、組織蛋白酶c和組織蛋白酶d)以及纖溶酶催化其裂解的單元。
[0303]
一些實施方式中，-ww-為二肽、三肽或四肽單元。
[0304]
在r2、r3、r4、r5或r6不為氫的條件下，r2、r3、r4、r5或r6所連接的碳原子為手性的。與r2、r3、r4、r5或r6連接的每個碳原子獨立地為(s)構型或(r)構型。
[0305]
在一些實施方式中，氨基酸單元為苯基丙氨酸-賴氨酸二肽(phe-lys或fk連接體)。在一些實施方式中，氨基酸單元為纈氨酸-瓜氨酸二肽(val-cit或vc連接體)。在一些
實施方式中，氨基酸單元為5-氨基戊酸、均苯基丙氨酸賴氨酸、四異喹啉羧酸酯賴氨酸、環己基丙氨酸賴氨酸、異酸(isonepecotic acid)賴氨酸、β-丙氨酸賴氨酸、甘氨酸絲氨酸纈氨酸谷酰胺或異酸。
[0306]
氨基酸單元可包含天然氨基酸。在其他實施方式中，氨基酸單元可包含非天然氨基酸。
[0307]
間隔單元
[0308]
當存在間隔單元(-y-)時，該間隔單元將氨基酸單元連接至藥物單元。間隔單元為兩個大類：自切除的(self-immolative)和非自切除的。非自切除的間隔單元為在tm-連接體-am偶聯物或藥物連接體化合物中的氨基酸單元酶裂解之后間隔單元的一部分或全部仍然連接于活化部分單元的間隔單元。非自切除間隔單元的實例包括但不限于：(甘氨酸-甘氨酸)間隔單元和甘氨酸間隔單元。當含有甘氨酸-甘氨酸間隔單元或甘氨酸間隔單元的tm-連接體-am偶聯物通過腫瘤細胞相關蛋白酶、癌細胞相關蛋白酶或淋巴細胞相關蛋白酶發生酶裂解時，甘氨酸-甘氨酸-藥物部分或甘氨酸-藥物部分從a-t-ww-中裂解出來。為了釋放出am，應當在靶細胞中進行獨立的水解反應，從而使甘氨酸-藥物單元化學鍵裂解。
[0309]
在典型的實施方式中，-yy-為可被qm取代的對氨基芐基醚，其中，q為-c
1-c8烷基，-c
1-c8烷氧基、-鹵素、-硝基或-氰基，并且m為0至4的整數。
[0310]
在一些實施方式中，非自切除間隔單元(-y-)為-gly-gly-。
[0311]
在一些實施方式中，非自切除間隔單元(-y-)為-gly-。
[0312]
在一些實施方式中，am-連接體化合物或tm-連接體-am偶聯物缺乏間隔單元(y＝0)。
[0313]
可選地，含有自切除間隔單元的tm-連接體-am偶聯物可釋放am(d)，無需單獨的水解步驟。在這些實施方式中，-y-為對氨基芐基醇(pab)單元，該對氨基芐基醇(pab)單元通過pab基團的氮原子與-ww-連接并且通過碳酸酯基團、氨基甲酸酯基團或醚基團直接連接于-d。
[0314]
自切除間隔單元的其他實例包括但不限于：與pab基團電子等價的芳香族化合物，例如，2-氨基咪唑基-5-甲醇衍生物(參見例如，hay等人,1999,bioorg.med.chem.lett.9:2237)和鄰位或對位-氨基芐基縮醛。可使用酰胺鍵水解后易于發生環化的間隔單元，例如，取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等人,1995,chemistry biology 2:223)，適當取代的雙環[2.2.1]和雙環[2.2.2]環系統(storm等人,1972,j.amer.chem.soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry等人,1990,j.org.chem.55:5867)。甘氨酸的α-位被取代的含胺藥物的消除(kingsbury等人,1984,j.med.chem.27:1447)也是自切除間隔單元的策略的實例，該策略可用于tm-連接體-am偶聯物。
[0315]
在可選的實施方式中，間隔單元為支鏈雙(羥甲基)苯乙烯(bhms)單元，其可用于合并多個部分。
[0316]
典型的間隔單元(-yy-)由通式(ix)-(xi)表示：
[0317][0318]
其中，q為c
1-c8烷基、c
1-c8烷氧基、鹵素、硝基或氰基，并且m為0至4的整數。
[0319][0320]
在一些實施方式中，連接體為酶可裂解的。在一些實施方式中，連接體不為酶可裂解的。
[0321]
iii.藥物劑型和給藥方式
[0322]
本發明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或一種以上藥學上可接受的載體。
[0323]
本文所述的化合物(例如，其加成鹽或水合物)以及藥學上可接受的載體可使用多種不同的給藥模式或途徑遞送至患者。合適的給藥途徑包括但不限于：吸入給藥、透皮給藥、口服給藥、直腸給藥、透過粘膜給藥、腸道給藥和腸胃外給藥(包括肌肉內、皮下和靜脈注射)。優選地，包含作為靶向部分的抗體或抗體片段的本發明的化合物以腸胃外的方式給藥，更優選地，以靜脈注射方式給藥。
[0324]
本文使用的術語“給藥”意在包括直接和間接地將化合物遞送至期望的作用位點的所有方式。
[0325]
本文所述的化合物或其藥學上可接受的鹽和/或其水合物可單獨給藥，與本發明的其他化合物聯合給藥和/或與其他劑聯合以混合劑的形式給藥。當然，對可與本發明的化合物聯合給藥的劑的選擇部分取決于中的病癥。
[0326]
例如，當向患有由依賴于自誘導物的生物體引起的疾病病癥的患者給藥時，本發明的化合物可以混合劑的形式給藥，所述混合劑含有用于疼痛、感染和其他癥狀以及通常與疾病有關的副作用的藥劑。這些藥劑包括例如，鎮痛劑、抗生素，等等。
[0327]
當向正在進行癌癥的患者給藥時，化合物可以混合劑的形式給藥，所述混合劑包含抗癌劑和/或補充增效劑。所述化合物還可以含有放療的副作用的藥劑的混合劑的形式給藥，所述放療的副作用的藥劑例如，止吐藥，防輻射劑，等等。
[0328]
可與本發明的化合物聯合給藥的補充增效劑包括例如，三環類抗抑郁藥(例如，米帕明(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米帕明(trimipramine)、多塞平(doxepin)、去甲替林(nortriptyline)、普羅替林(protriptyline)、阿莫沙平(amoxapine)和馬普替林(maprotiline))，非三環類抗抑郁藥(例如，舍曲林(sertraline)、曲唑酮(trazodone)和西酞普蘭(citalopram))，ca2+拮抗劑(例如，維拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼地平(nitrendipine)和卡羅維林(caroverine))，兩性霉素，三苯乙醇類似物(例如，它莫昔芬(tamoxifen))，抗心律失常藥物(例如，奎尼丁(quinidine))，抗高血壓藥物(例如，
利血平(reserpine))，硫醇消耗物(例如，丁硫氨酸和亞砜亞胺)以及甲酰四氫葉酸鈣。
[0329]
本發明的活性化合物以其自身的形式給藥或者以藥物組合物的形式給藥，在所述藥物組合物中，所述活性化合物與一種或一種以上藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑混合。根據本發明使用的藥物組合物通常使用一種或一種以上生理學可接受的載體以常規方式配制，所述生理學可接受的載體包含賦形劑和佐劑，所述生理學可接受的載體有利于將活性化合物加工成可在藥學上使用的制劑。合適的劑型取決于所選擇的給藥途徑。
[0330]
對于透過粘膜給藥而言，在劑型中使用適于待穿透的屏障的滲透劑。這些滲透劑通常為本領域已知的。
[0331]
對于口服給藥而言，化合物易于通過將活性化合物與本領域已知的藥學上可接受的載體結合配制。這些載體能夠使本發明的化合物配制成由待的患者口服的片劑、藥丸、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿狀物和懸浮液。口服的藥物制劑可通過如下方式獲得：將固體賦形劑與活性劑化合物混合，任選地研磨得到的混合物，并對顆粒混合物進行加工，如果想要得到片劑或糖衣片芯的話，需要在該過程之前加入合適的佐劑。具體而言，合適的賦形劑為填充劑(例如，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖)，纖維素制劑(例如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明膠、黃耆膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧乙基纖維素鈉)和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要的話，可加入崩解劑，例如，交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽(例如，海藻酸鈉)。
[0332]
向糖衣片芯提供合適的包衣。為了實現這個目的，可使用濃縮的糖溶液，該溶液可任選地含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆用溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可將染料或顏料加至片劑或糖衣藥丸包衣中，用于識別或表征不同的活性化合物劑量組合。
[0333]
可口服使用的藥物制劑包括由明膠制成的推合式膠囊和由明膠和增塑劑(例如，丙三醇或山梨糖醇)制成的軟的密封的膠囊。推合式膠囊可含有與諸如乳糖之類的填充劑、諸如淀粉之類的粘合劑和/或諸如滑石粉或硬脂酸鎂之類的潤滑劑和任選地穩定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解于或懸浮于合適的液體中，例如，脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可加入穩定劑。用于口服給藥的所有劑型的劑量應當適于這種給藥方式。
[0334]
對于口腔給藥而言，組合物可以通過常規方式配制的片劑或含片的形式給藥。
[0335]
對于吸入給藥而言，根據本發明使用的化合物便于通過使用合適的推進劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)以由加壓包或噴霧器提供的噴霧的形式遞送。在使用加壓噴霧的情況下，劑量單位可通過提供遞送計量的量的閥來確定。在吸入器或吹入器中使用的膠囊和藥筒(例如，明膠膠囊和藥筒)可被配制為含有化合物和合適粉末基體(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的劑型。
[0336]
化合物可被配制為通過注射(例如，快速注射或連續輸注)方式腸胃外給藥的劑型。注射為本發明的組合物的優選的給藥方法。用于注射的劑型可以帶有添加的防腐劑的單位劑量形式提供，例如，以安瓶或多劑量容器的形式提供。組合物可采用諸如油性載體或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液之類的形式并且可含有諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑之類的調配劑(formulatory)，并且可加入例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽(例如，海藻酸鈉)。
[0337]
用于腸胃外給藥的藥物劑型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的懸浮液可制備成合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂質體。水性注射懸浮液可包含如下物質：該物質增加懸浮液的粘度，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液還可含有合適的穩定劑或藥劑，該穩定劑或藥劑增加化合物的溶解度，從而制備高度濃縮的溶液。對于注射而言，本發明的藥劑可被配制成水性溶液，優選地配制成生理相容性緩沖液(例如，hanks溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液)。
[0338]
可選地，活性成分可為使用前溶解于合適的載體中的粉末形式，所述合適的載體例如，無菌無熱原水。
[0339]
化合物還可被配制成直腸用組合物，例如，栓劑或保留灌腸劑型，例如含有常規栓劑基體(例如可可油或其他甘油酯)。
[0340]
除了前述劑型之外，化合物還可被配制成長效制劑。這種長期起效的劑型可通過植入或經皮遞送(例如，皮下遞送或肌肉內遞送)、肌肉內注射或透皮貼劑給藥。因此，例如，化合物可通過合適的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂配制或可將化合物配制成微溶衍生物，例如，配制成微溶的鹽。
[0341]
藥物組合物還可包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、淀粉、纖維素衍生物、明膠和諸如聚乙二醇之類的聚合物。
[0342]
優選的藥物組合物為配制成注射劑型的組合物，例如，靜脈注射劑型，并且該優選的藥物組合物包含基于總的100重量％的藥物組合物的約0.01重量％至約100重量％的本發明的化合物。藥物配體偶聯物可為抗體-細胞毒素偶聯物，其中，選擇靶向特定癌癥的抗體。
[0343]
在一些實施方式中，本發明的藥物組合物還包含第二化療劑。
[0344]
本文中的“化療劑”是指在癌癥中有用的化學化合物。實例包括但不限于：吉西他濱(gemcitabine),伊立替康(irinotecan),阿霉素(doxorubicin),5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil),阿糖胞苷(cytosine arabinoside，“ara-c”),環磷酰胺(cyclophosphamide),塞替派(thiotepa),白消安(busulfan),細胞毒素,紫杉酚,甲氨蝶呤(methotrexate),順鉑(cisplatin),美法侖(melphalan),長春堿(vinblastine)和卡鉑(carboplatin)。
[0345]
在一些實施方式中，第二化療劑選自：他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),來曲唑(letrozole),伊馬替尼(imatanib),紫杉醇(paclitaxel),環磷酰胺(cyclophosphamide),洛伐他汀(lovastatin),含羞草素(minosine),吉西他濱(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他賽(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),長春新堿(vincristine),長春堿(vinblastine),諾考達唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他濱,埃博霉素(epothilone),長春瑞濱(vinorelbine),喜樹堿(camptothecin),柔紅霉素(daunorubicin),放線菌素d(actinomycin d),米托蒽醌(mitoxantrone),吖啶(acridine),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔紅霉素(idarubicin)。
[0346]
iv.試劑盒
[0347]
另一方面，本發明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本發明的化合物或組合物中的一種或一種以上以及使用所述化合物或組合物的說明書。在示例性的實施方式中，本發明提供用于將本發明的連接體臂與另一分子偶聯的試劑盒。所述試劑盒包括連接體和用于使連接體與特定的官能團連接的說明書。所述試劑盒還包括細胞毒物、靶向劑、可檢測的標記、藥學上可接受的鹽或緩沖劑中的一種或一種以上。所述試劑盒還可包括容器和任選地一種或一種以上小瓶、測試管、燒瓶、瓶子或注射器。其他形式的試劑盒對于本領域技術人員而言是顯而易見的并且在本發明的范圍內。
[0348]
v.醫療用途
[0349]
另一方面，本發明提供一種用于需要這種的受治者體內的疾病病癥的方法，所述方法包括將藥物組合物給藥于所述受治者，所述藥物組合物包含有效量的本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
[0350]
除了上述組合物和構建體之外，本發明還提供本發明的化合物的多種用途。本發明的化合物的用途包括：殺死腫瘤細胞或癌細胞或者抑制腫瘤細胞或癌細胞的生長或復制，癌癥、癌前癥狀、預防腫瘤細胞或癌細胞繁殖、預防癌癥、預防表達自體免疫抗體的細胞繁殖。這些用途包括將有效量的本發明的化合物給藥于有此需要的諸如哺乳動物或人類之類的動物。
[0351]
本發明的化合物可用于諸如人類之類的動物體內的疾病(例如，癌癥)。本發明提供組合物及其在腫瘤中的用途，所述用途包括以藥學上可接受的方式向受治者提供藥學有效量的本發明的組合物。
[0352]
本文中的“癌癥”是指人體內的病理狀態，其特征為不受控制的細胞增殖。實例包括但不限于：癌癥、淋巴瘤、母細胞瘤和白血病。癌癥的更加具體的實例包括但不限于：肺(小細胞和非小細胞)癌、乳腺癌、前列腺癌、類癌性癌癥、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝細胞癌)、肝母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、食管癌、卵巢癌、子宮癌、子宮內膜癌、間皮瘤、黑素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲狀腺癌、硬纖維瘤、急性髓細胞白血病(aml)和慢性髓細胞白血病(cml)。
[0353]
本文中的“抑制”或“”是指降低、性和預防性，其中，目的是降低或預防指定的病理性失調或病癥。在一個實施例中，給藥本發明的化合物之后，癌癥患者可經歷腫瘤尺寸減小。“”包括(1)抑制患有或表現出疾病的病理或癥狀的受治者體內的疾病；(2)緩解患有或表現出疾病的病理或癥狀的受治者體內的疾病；和/或(3)影響患有或表現出疾病的病理或癥狀的受治者或患者體內的疾病的任何可測量的降低。本發明的化合物在一定程度上可防止癌細胞生長和/或殺死癌細胞，在該程度上的本發明的化合物可為抑制細胞生長的和/或細胞毒性的。
[0354]
本文中的“有效量”是指有效“”受治者或哺乳動物體內的失調的本文提供的化合物的量。在癌癥的情況下，有效量的藥物可降低癌細胞的數目，使腫瘤尺寸減小，抑制癌細胞浸潤進入外周器官，抑制腫瘤轉移，抑制腫瘤生長至某一程度，和/或一定程度地減輕與癌癥相關的癥狀中的一種或一種以上。
[0355]
與一種或一種以上其他劑“聯合”給藥包括同時給藥和以任何順序連續給藥。本文使用的術語“藥物組合”是指通過混合活性成分或組合活性成分得到的產品，并且包括
活性成分的固定組合和非固定組合這兩者。術語“固定組合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和聯合藥劑以單個實體或劑量同時給藥于患者。術語“非固定組合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和聯合藥劑作為分開的實體同時或按順序(沒有特定的時間限制)給藥于患者，這種給藥向患者體內提供有效量的活性成分。后者還用于混合劑，例如，給藥三種或三種以上活性成分。
[0356]
在一些實施方式中，所述疾病病癥為腫瘤。
[0357]
在一些實施方式中，所述疾病病癥包括異常細胞增殖，例如癌前病變。
[0358]
本發明尤其對于動物體內的癌癥和抑制動物體內的腫瘤細胞的繁殖或癌細胞的繁殖有用。癌癥或癌前病癥包括腫瘤、轉移或任何特征為不受控制的細胞生長的疾病或失調，癌癥或癌前病癥可通過給藥本發明的藥物-配體復合物來或預防。化合物將活化部分遞送至腫瘤細胞或癌細胞。在一些實施方式中，靶向部分與癌細胞或腫瘤細胞相關抗原特異性結合。由于活化部分靠近配體，所以在內在化之后，活化部分可通過例如受體介導的內吞作用被攝取進入腫瘤細胞或癌細胞的內部。抗原可連接至腫瘤細胞或癌細胞或者可為與腫瘤細胞或癌細胞有關的細胞外基質蛋白質。一旦進入細胞內部，連接體以水解的方式裂解或被腫瘤細胞相關蛋白酶或癌細胞相關蛋白酶以酶的方式裂解，從而釋放活化部分。釋放的活化部分隨后自由擴散并誘導或提高免疫細胞或腫瘤細胞的免疫活性。在可選的實施方式中，活化部分從化合物腫瘤微環境中裂解出來，隨后藥物滲入細胞。
[0359]
可被本發明的化合物靶定的癌前癥狀的代表性的實例包括：化生、增生、異常、結腸直腸息肉、光化性角化病、光化性唇炎、人乳頭瘤病毒、白斑、扁平苔蘚和博溫氏病。
[0360]
可被本發明的化合物靶定的癌癥或腫瘤的代表性實例包括：肺癌、結腸癌、前列腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、cns癌、腎臟癌、腎癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、子宮頸癌和白血病。對于本領域普通技術人員來說明顯的是，可選擇使活化部分靶定待用藥物的腫瘤組織的在化合物中使用的特定靶向部分(即，選擇對腫瘤特異性抗原具有特異性的靶向劑)。這種靶向部分的實例是本領域已知的，實例包括用于乳腺癌的抗her2，用于淋巴瘤的抗cd20，用于前列腺癌的抗psma和用于淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤)的抗cd30。
[0361]
在一些實施方式中，異常增殖的細胞是癌細胞。
[0362]
在一些實施方式中，癌癥選自：乳腺癌、結腸直腸癌、彌漫性大b細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、濾泡性淋巴瘤、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、肺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和腎細胞癌。
[0363]
在一些實施方式中，本發明提供用于殺傷細胞的化合物。所述化合物以足以殺傷所述細胞的量給藥于細胞。在示例性的實施方式中，所述化合物給藥于帶有所述細胞的受治者。在另一示例性的實施方式中，所述給藥使腫瘤的生長延遲或停止，所述腫瘤包括所述細胞(例如，所述細胞可為腫瘤細胞)。對于延遲生長的給藥而言，所述細胞的生長速度應當為比給藥前的生長速度小至少10％。優選地，生長速度會延遲至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或完全停止。
[0364]
有效劑量
[0365]
適用于本發明的藥物組合物包括包含有效量的活性成分的組合物，所述有效量即為有效實現期望目的的量。對特定應用有效的實際量將(尤其)取決于中的病
癥。有效量的確定恰好在本領域技術人員的能力范圍內(尤其是根據本文具體公開的內容)。
[0366]
對于本文所述的任何化合物而言，有效量可最先通過細胞培養檢測法確定。目標血藥濃度為能夠抑制細胞生長或分裂的活性化合物的濃度。在優選的實施方式中，細胞活性的至少25％被抑制。能夠誘導至少約30％、50％、75％或甚至90％或者更高的細胞活性抑制的活性化合物的目標血藥濃度為目前優選的。可監測患者體內的細胞活性抑制的百分數，從而評估所達到的血藥濃度的適當性，并且可上調或下調劑量以實現期望的抑制百分數。
[0367]
如本領域已知的，用于人體的有效量還可通過動物模型來確定。例如，用于人體的劑量可被配制成實現已在動物體內發現的有效循環濃度。如上所述，人體內的劑量可通過監測細胞抑制和上調或下調劑量來調節。
[0368]
有效劑量還可通過已知的表現出類似藥理學活性的化合物的人體數據來確定。所使用的劑量可基于與已知化合物比較的所給藥的化合物的相對生物利用度和效力來調節。
[0369]
基于上述方法和本領域熟知的其他方法為實現人體內的最大效力對劑量進行調節恰好在本領域普通技術人員的能力范圍內。
[0370]
在局部給藥的情況下，所給藥的化合物的全身循環濃度不是特別重要。在這種情況下，給藥化合物以達到在局部區域有效實現期望的結果的濃度。
[0371]
對于預防和/或與異常細胞增殖有關的疾病方面的應用而言，優選的是，所給藥的化合物的循環濃度為約0.001μm至20μm，優選地約0.01μm至5μm。
[0372]
本文所述的化合物的口服給藥的患者劑量典型地為約1mg/天至約10,000mg/天，更加典型地為約10mg/天至約1,000mg/天，最典型地為約50mg/天至約500mg/天。按照患者體重而言，典型的劑量為約0.01mg/kg/天至約150mg/kg/天，更加典型地為約0.1mg/kg/天至約15mg/kg/天，最典型地為約1mg/kg/天至約10mg/kg/天，例如，5mg/kg/天或3mg/kg/天。
[0373]
在至少一些實施方式中，延遲或抑制腫瘤生長的患者劑量可為1μmol/kg/天或更少。例如，患者劑量可為0.9μmol/kg/天、0.6μmol/kg/天、0.5μmol/kg/天、0.45μmol/kg/天、0.3μmol/kg/天、0.2μmol/kg/天、0.15μmol/kg/天或0.1μmol/kg/天或更少(參考藥物的摩爾數)。優選地，當以每日劑量給藥持續至少五天的時間段時，抗體藥物偶聯物延遲腫瘤生長。
[0374]
對于其他給藥模式而言，劑量和間隔可分開調節，從而提供對于中的特定臨床適應癥有效的給藥的化合物的血藥濃度。例如，在一種實施方式中，根據本發明的化合物可以相對高的濃度每天多次給藥。可選地，更加理想的是，以最小有效濃度給藥本發明的化合物并且使用較低頻率的給藥方案。這會提供與個體的疾病的嚴重程度相稱的方案。
[0375]
使用本文的教導可安排有效的方案，而不導致較大的毒性，并且還完全有效地特定患者表現出的臨床癥狀。這種安排應當包括通過考慮多種因素仔細選擇活性化合物，所述多種因素例如，化合物效力、相對生物利用度、患者體重、存在的不良副作用及其嚴重性、優選的給藥模式和所選擇的藥劑的毒性特征。
[0376]
雖然本文描述并顯示了本發明的優選的實施方式，但是對于本領域技術人員而言顯而易見的是，這些實施方式僅僅是舉例說明。本領域技術人員可對這些實施方式作出多
種改變、修改和替換，而不背離本發明。應當理解的是，本文所述的本發明的可選實施方式可用于實踐本發明。通過所附的權利要求來限定本發明的范圍，并且這些權利要求范圍內的方法和結構及其等同物也被所附的權利要求涵蓋。
[0377]
實施例
[0378]
本發明進一步通過下述實施例舉例說明，但本發明不限于此，下述實施例舉例說明本發明的化合物的制備方法。
[0379]
實施例1
[0380]
her2或egfr轉染的l細胞系的生成
[0381]
試劑：來自atcc(manassas,va；cat no.crl2648)的l細胞，購自sino biological inc.,(cat no.h10004)或genecopoeia,(cat no.z2866)的her2/pez-lv105或egfr/pcmv cdna,葡萄糖dmem,l-谷酰胺,lipofectamine 2000(invitrogen；carlsbad,ca)。
[0382]
為了制備用于篩選偶聯的曲妥珠單抗的細胞系，生成表達標記的her2或egfr的l細胞。her2/pez-lv105或egfr/pcmv cdna構建體通過標準lipofectamine 2000操作規程轉染至l細胞(該細胞在高濃度葡萄糖dmem+10％ fbs+2mm l-谷酰胺中生長)。
[0383]
結合分析(facs分析)
[0384]
為了確定偶聯的曲妥珠單抗的結合能力，對表達人her2的l細胞進行facs分析。簡言之，將100μl大約106個帶有瞬時轉染的her2的l細胞與不同量的曲妥珠單抗偶聯的抗體一同孵育，使用pbs或單獨的二抗或不相關huigg作為陰性對照。洗滌之后，將細胞重懸于facs緩沖液中并在100μl反應體積中在室溫下與偶聯至藻紅蛋白(mu抗人pe)二抗的20μl小鼠抗人igg一同孵育30分鐘。洗滌之后，將細胞固定在200μl 2％多聚甲醛/pbs中，隨后進行流式細胞儀分析。將相同的步驟用于作為同種型對照的不相關人igg抗體以設定基線pmt/細胞系。在bd上進行流式細胞儀分析并且記錄每個樣品的幾何平均熒光強度。使用flowjo軟件分析記錄的數據。結果在圖1中顯示。
[0385]
抗體toll樣受體配體偶聯物的生成
[0386]
試劑：曲妥珠單抗(roche/genentech corporation,south san francisco,ca)、西妥昔單抗(merck)、與瑞喹莫德連接的mc-val-cit-pab(mc-vc-pab-tlrl)或與瑞喹莫德連接的mc-(mc-tlrl)(在contract research organization,china合成)、硼酸鈉、氯化鈉、二硫蘇糖醇(dtt)、sephadex g25、dtpa、dtnb和馬來酰亞胺基己酰基-單甲基(sigma-aldrich,milwaukee,wisconsin)。
[0387]
用于生成抗體tlr配體偶聯物的藥物包括曲妥珠單抗和瑞喹莫德(tlrl)，在一些情況下，西妥昔單抗用于偶聯物。用于生成tlac的連接體為可裂解的連接體mc-vc-pab或非可裂解的連接體mc。
[0388]
曲妥珠單抗mc-tlrl或西妥昔單抗mc-tlrl的制備
[0389]
曲妥珠單抗通過20mg/ml濃度下的緩沖液交換從中純化出來，在ph為8.0的條件下溶解于500mm硼酸鈉和500mm氯化鈉的抗體用過量的100mm二硫蘇糖醇(dtt)處理。在37℃孵育約30分鐘之后，通過在sephadex g25樹脂上的洗脫交換緩沖液并用含有1mm dtpa的pbs進行洗脫。硫醇/ab值通過測定還原的抗體的濃度和硫醇濃度來檢測，所述還原的抗體的濃度通過溶液在280nm的吸光度來檢測，所述硫醇濃度通過與dtnb(sigma-aldrich,milwaukee,wisconsin)反應以及在412nm處的吸光度來確定。溶解于pbs
biosciences,piscataway,nj；cat no.17-1440-02)，96孔板(costar,cat no.3599,cat no.3916)，臺盼藍(invitrogen cat no 15250-061)，ldh試劑盒(promega,cat no.g7891)，elisa測讀儀md5(molecule device)。人源化抗體(genentech corporation,south san francisco,ca；商品名曲妥珠單抗)在使用前復溶于水中以制成10mg/ml原液。
[0395]
為了確定與高效負載的tlrl偶聯的曲妥珠單抗是否仍然具有效應功能，檢測幾種不同偶聯形式的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)活性并且與已顯示出具有顯著提高的adcc活性的曲妥珠單抗參比材料相比。使用來自于健康供體的外周血單核細胞(pbmc)作為效應細胞、使用人skbr3細胞系作為靶細胞進行adcc分析。第一天，將1
×
104/100μl skbr3細胞接種于96孔平板上，隨后在37℃、5％co2條件下，孵育48小時。
[0396]
在第三天，由從健康自愿供體獲得的人血液制備新鮮的人pbmc。人靜脈血樣品收集在檸檬酸銨(acd-a)管中。將管顛倒數次，將全部血液轉移至一個50ml圓錐管中。用2％fbs中的pbs以1:3稀釋血液。將ficoll-hypaque緩慢分配至血液/pbs混合物底部。在室溫下以2400rpm的速度對樣品進行離心分離持續30分鐘，隨后通過抽吸除去上層(血漿/pbs)。血沉層(buffy coat)用無菌移液管收集并匯集在50ml圓錐管中。如果在血沉層下仍然可見wbc塊，那么收集所有wbc物質，小心不要除去過多的ficoll-hypaque。加入無菌pbs-2％ fbs并通過倒置混合。在室溫、250
×
g的條件下對稀釋的pbmc懸浮液進行離心分離持續20分鐘，收集細胞小粒。pbmc小粒懸浮于具有2％熱滅活的fbs的rpmi-1640培養基，洗滌并通過臺盼藍排除法檢查活細胞數。制備1.2
×
107細胞/ml的密度待用。同時，在rpmi-1640中制備抗體的最終濃度為從12μg/ml、4μg/ml、1.2μg/ml、0.4μg/ml、0.12μg/ml、0.04μg/ml、0.012μg/ml、0.004μg/ml至0μg/ml。
[0397]
隨后將一系列測試抗體和對照抗體的稀釋液加至含有靶細胞的孔中，將50μl rpmi-1640培養基中的pbmc效應細胞加至每個孔中(效應細胞與靶細胞的比例為60:1)，并且再孵育17小時。在孵育結束時對平板進行離心處理并使用ldh測量試劑盒分析上清液中的乳酸鹽脫氫酶(ldh)活性。細胞溶解使用酶標儀通過490nm處的吸光度定量。僅含有靶細胞的孔的吸光度作為背景對照，而含有用triton-x100溶解的靶細胞的孔提供最大可獲得信號。非抗體依賴性細胞毒性在含有靶細胞和效應細胞而未加入抗體的孔中測量。細胞毒性根據下列方程計算：
[0398]
％細胞毒性＝100％x[a490nm(樣品)
–
a490(靶細胞)
–
a490(效應細胞]/[a490nm(溶解的靶細胞)
–
a490nm(靶細胞)]
[0399]
相對于抗體濃度繪制一式兩份樣品稀釋液中的平均adcc值，并且通過擬合至prism 5(graphpad)得到ec50值和adcc(％)最大程度。
[0400]
從pbmc中富集人樹突細胞(dc)
[0401]
通過ficoll離心，由從健康的自愿供體中獲得的血沉層制備人pbmc。通過使用負向消減，由具有來自人pbmc的抗cd3抗體、抗cd19抗體、抗cd20抗體、抗cd14抗體和抗cd16抗體的混合物的磁珠(miltenyi biotec)富集樹突細胞。用山羊抗小鼠fitc(譜系)、hla-dr-apccy7、cd123-bv421和cd11c-apc對富集的dc進行染。染的細胞在bd lsr fortessa上進行分析。抗cd3單克隆抗體、抗cd4單克隆抗體、抗cd11c單克隆抗體、抗cd19單克隆抗體、抗cd14單克隆抗體、抗cd16單克隆抗體、抗cd123單克隆抗體購自bd biosciences或biolgend。
[0402]
圖3(a)表示富集前后dc的百分數。上部的兩個圖中的數字表示譜系消減前后總細胞的dc(hla-dr+lin-)百分數。下部圖中的數字表示譜系消減前后總dc的mdc(cd11c+cd123-)和pdc(cd123+cd11c-)的百分數。
[0403]
對富集的人dc的刺激以及細胞因子表達
[0404]
將1-2
×
105富集的dc接種于100μl培養基中的96孔平板中，將100μl稀釋的刺激劑加至平板中并在37℃的孵育器中培養20至22小時。收集上清液并通過elisa(mabtech ab)分析人ifn-α,il-6,il-12(p70)和tnf-α。
[0405]
統計學分析
[0406]
所有比較的顯著性使用student雙尾t檢測計算，假設模擬組和樣品組之間的方差不相等，當p《0.05時認為結果是顯著的。參數之間的相關性使用斯皮爾曼秩相關測試評價，p值《0.05被認為是統計學上顯著的。
[0407]
使用曲妥珠單抗tlrl偶聯物或西妥昔單抗tlrl偶聯物進行體內腫瘤細胞殺傷試驗
[0408]
對于源自患者的胃癌異種移植物(pdx)小鼠模型的研究而言，將6至8周齡的雌性balb/c裸鼠(獲自slac,shanghai,china)用于腫瘤碎片移植。根據動物護理和使用委員會(institutional animal care and use committee)的實驗室動物護理和使用指南和規程，用正常裸鼠飲食飼養動物并且將動物養在spf動物設施中。將尺寸為約15mm3至30mm3的患者sto#69胃腫瘤碎片移植(皮下地)到balb/c裸鼠的右側。
[0409]
對于肺癌異種移植物模型的研究而言，將6至8周齡的雌性balb/c裸鼠用于腫瘤碎片移植。在含有10％血清的rpmi-1640培養基中培養人肺癌細胞系h1650(atcc,cat.#crl5883)，并且將其移植(皮下地)到balb/c裸鼠的右側。每個小鼠每次接種接受100μl基底膜中的2
×
106個細胞。
[0410]
通過靜脈注射途徑給藥含有5mg/kg至20mg/kg抗體的藥物或含有20mg/kg特羅凱(tarceva)或參比藥物(qwkx3)的藥物。通過卡尺每周測量一次腫瘤以確定其皮下生長。用卡尺每周測量兩次腫瘤的二維尺寸。使用如下方程式計算腫瘤體積：腫瘤體積＝(長度
×
寬度2)
×
0.5。平均腫瘤體積或體重使用畫圖程序prism 5(graphpad)繪制。效力研究的終點設置在第一次后30天至45天或者當腫瘤尺寸達到2000mm3以上時(無論哪個先達到)。如果小鼠失去超過20％的體重或者病得很重并且無法得到足夠的食物或水，那么將其從研究中除去并實施安樂死。在終點收集小鼠的腫瘤，在ln2中半冷凍并在福爾馬林中半固定，用于制備ffpe組織。
技術特征：
1.一種具有通式(i)的結構的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm為靶向部分，am為能夠活化人樹突細胞、nk細胞或腫瘤細胞或者它們的組合的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數。2.如權利要求1所述的化合物，其中，所述人樹突細胞為漿細胞樣樹突細胞。3.如權利要求1所述的化合物，其中，所述人樹突細胞為髓樣樹突細胞。4.如權利要求1所述的化合物，其中，am能夠特異性結合人tlr7或人tlr8。5.如權利要求1所述的化合物，其中，am能夠特異性結合人tlr7和人tlr8。6.一種具有通式(i)的結構的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm為靶向部分，am為能夠特異性結合人tlr7和/或人tlr8的活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數。7.如權利要求6所述的化合物，其中，am能夠特異性結合人tlr7和人tlr8這兩者。8.如權利要求1至7任一項所述的化合物，其中，當tm包含抗體時，am不包含cpg寡核苷酸。9.如權利要求1至8任一項所述的化合物，其中，所述靶向部分能夠特異性結合腫瘤細胞或相對于非腫瘤細胞優先結合腫瘤細胞。10.如權利要求9所述的化合物，其中，所述腫瘤細胞為癌細胞、肉瘤細胞、淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞或中樞神經系統癌癥細胞。11.如權利要求1至8任一項所述的化合物，其中，所述靶向部分能夠特異性結合腫瘤抗原或者相對于非腫瘤抗原優先結合腫瘤抗原。12.如權利要求11所述的化合物，其中，所述腫瘤抗原選自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。13.如權利要求11所述的化合物，其中，所述腫瘤抗原選自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纖連蛋白,葉酸鹽受體,神經節苷酯gm3,gd2,糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整聯蛋白αν,整聯蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y,間皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘連蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配體蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它們的變體。14.如權利要求1至13中任一項所述的化合物，其中，所述靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白質、肽、小分子、納米顆粒或核酸。15.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含抗體或其功能片段。16.如權利要求15所述的化合物，所述抗體選自：美羅華(利妥昔單抗)、赫賽汀(曲妥珠單抗)、愛必妥(西妥昔單抗)、維克替比(帕尼單抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(貝利木單抗)、yervoy(伊匹單抗)、perjeta(帕妥珠單抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。17.如權利要求15所述的化合物，其中，所述靶向部分包含fab、fab’、f(ab’)2、單結構
域抗體、t和abs二聚物、fv、scfv、dsfv、ds-scfv、fd、線性抗體、微小抗體、雙體抗體、雙特異性抗體片段、bibody、tribody、sc-雙體抗體、κ(λ)body、bite、dvd-ig、sip、smip、dart或者含有一個或一個以上cdr的抗體類似物。18.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反應蛋白-1模擬物、cdcrgdcfcg(環狀)多肽、sch221153片段、ncngrc(環狀)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奧曲肽、伐普肽、蘭樂肽、c-3940多肽、達必佳、利普安、諾雷德或西曲瑞克。19.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含葉酸或其衍生物。20.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含細胞外結構域(ecd)或pd-1,ctla4,btla,kir,tim3,4-1bb,lag3的可溶形式、全長的部分表面配體雙調蛋白、β動物纖維素、egf、肝配蛋白、epigen、上皮調節蛋白、igf、神經調節蛋白、tgf、trail或vegf。21.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含納米顆粒。22.如權利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含適體。23.如權利要求1至22任一項所述的化合物，其中，所述活化部分包含：(a)單鏈rna(ssrna)，優選地為orn02、orn06、sspoly(u)、ssrna40、ssrna41、ssrna-dr或poly(dt)；或者(b)受體配體類似物，優選地為cl075、cl097、cl264、cl307、gardiquimod、洛索立賓、咪喹莫特或瑞喹莫德。24.如權利要求23所述的化合物，其中，am包含瑞喹莫德(r848)。25.如權利要求1至24任一項所述的化合物，其中，所述連接體選自：肼基團、多肽、二硫化物基團和硫醚基團。26.如權利要求1至24任一項所述的化合物，其中，所述連接體為酶可裂解的。27.如權利要求1至24任一項所述的化合物，其中，所述連接體不為酶可裂解的。28.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1至27中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或一種以上藥學上可接受的載體。29.如權利要求28所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含第二化療劑。30.如權利要求29所述的藥物組合物，其中，所述化療劑選自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),來曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,環磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他濱(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他賽(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),長春新堿,長春堿,噻氨酯噠唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他濱,埃博霉素,長春瑞濱(vinorelbine),喜樹堿,道諾霉素(daunorubicin),放線菌素d,米托蒽醌,吖啶,阿霉素,表柔比星,或去甲氧基柔紅霉素。31.一種需要這種的受治者體內的疾病病癥的方法，所述方法包括將藥物組合物給藥于所述受治者，所述藥物組合物包含有效量的權利要求1至27任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。32.如權利要求31所述的方法，其中，所述疾病病癥為腫瘤。33.如權利要求31所述的方法，其中，所述疾病病癥包括異常細胞增殖。34.如權利要求33所述的方法，其中，所述異常細胞增殖包括癌前病變。
35.如權利要求33所述的方法，其中，所述異常增殖的細胞為癌細胞。36.如權利要求35所述的方法，其中，所述癌癥選自：乳腺癌、結腸直腸癌、彌漫性大b細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、濾泡性淋巴瘤、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、肺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和腎細胞癌。37.一種具有通式(i)的結構的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm為靶向部分，am為活化部分，ln為連接體，n為選自0和1的整數，條件是當tm包含抗體時，am不包含cpg寡核苷酸或劑。38.如權利要求37所述的化合物，其中，所述活化部分包含tlr配體(tlrl)、nod樣受體配體、rig樣受體配體、clr配體、cds配體或炎性體誘導物。39.如權利要求38所述的化合物，其中，所述活化部分包含一種或一種以上選自下列的tlr的配體：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9和tlr10。40.如權利要求39所述的化合物，其中，所述活化部分包含：(i)tlr2的配體，其選自：(a)熱殺死的細菌產物，優選地為hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)細胞壁成分產物，優選地為lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；(ii)tlr3的配體，其選自：poly(i:c)和poly(a:u)；(iii)tlr4的配體，其選自：lps和mpla；(iv)tlr5的配體，其選自：fla和鞭毛蛋白；(v)tlr7/8的配體，其選自：orn02,orn06,sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,poly(dt),cl075,cl097,cl264,cl307,gardiquimod,洛索立賓,咪喹莫特,和瑞喹莫德；(vi)tlr9的配體，其選自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；(vii)tlr10的配體；(viii)核苷酸-寡聚結構域(nod)樣配體，其選自：nod1激動劑(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激動劑(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羥乙酰基-mdp)和nod1/nod2激動劑(m-tridap,pgn)；(ix)一種或一種以上rig-i樣受體(rlr)的配體，其選自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；(x)一種或一種以上c型植物凝集素受體(clr)的配體，其選自：凝膠多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山崳酸鹽；(xi)一種或一種以上細胞溶質dna傳感器(cds)的配體，其選自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；或(xii)炎性體誘導物，其選自：(a)nlrp3炎性體蛋白質復合物，優選地為明礬晶體，atp，cppd晶體，hermozoin，msu晶體，納米sio2，尼日利亞菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性體蛋白質復合物，優選地為poly(da:dt)。41.如權利要求37所述的化合物，其中，所述活化部分包含imo2134、imo205、mgn-1703、mgn-1704、agatolimod、sd-101、qax-935、dims0150、pollinex quattro、om-174、eritoran、
tak-242、ni-0101、i型干擾素、ii型干擾素、iii型干擾素、il-12、il-23、il-18、il-7或il-15。
技術總結
本發明公開了用于靶向免疫療法的化合物，含有該化合物的組合物以及該化合物在諸如癌癥之類的疾病的方面的應用。所述化合物具有通式TM-Ln-AM的結構，其中，TM是靶向部分，AM是能夠活化人樹突細胞、K細胞或腫瘤細胞或者它們的組合的活化部分，Ln是連接體，并且n是選自0和1的整數。自0和1的整數。
