一種體外誘導IPS細胞分化生成人軟骨組織的方法與流程
一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法
技術領域
1.本發明涉及軟骨細胞分化技術領域，具體為一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法。
背景技術：
2.軟骨組織是一種富含蛋白多糖、膠原和透明質酸等物質的組織，由軟骨細胞和軟骨基質構成，在體內主要起支撐和減少摩擦的作用。但軟骨組織缺乏血管，因此，軟骨組織一旦受到損傷便很難修復，即便是微小的軟骨組織損傷，也很難自然修復。目前，臨床上用于軟骨組織損傷修復的方法主要有軟骨和軟骨下骨去除、微骨折和軟骨下骨鉆孔、自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植、軟骨或骨膜移植等。這些方法在一定程度上均能夠對軟骨組織損傷進行修復，但均存在明顯缺點，如微骨折和軟骨下骨鉆孔方法能夠使干細胞到達損傷部位，但因局部環境和機械應力不同，干細胞很難向軟骨細胞分化；自體骨軟骨移植安全、有效，但會給患者帶來新的創傷；異體骨軟骨移植避免了自體骨軟骨移植給患者帶來的新的創傷，但存在供體來源限制、免疫排斥反應和疾病傳播風險等。
3.誘導多能干細胞是指通過一定的方法，將某些特定的轉錄因子轉入到已分化的成體細胞，使其重編程為形態和功能上類似于胚胎干細胞的一類細胞。由于其避開了既往胚胎干細胞研究在細胞來源和倫理道德方面等問題，從一誕生起就迅速引發了科學界的強烈興趣，并在再生醫學、疾病建模及新型藥物篩選方面展現出極大的優勢。軟骨由于其組織結構的特異性，缺乏神經血管分布，出現局部破壞和缺損后難以自行修復，常造成不同程度的關節功能障礙乃至整個關節功能的喪失。
4.目前研究發現采用ips細胞誘導培養軟骨細胞是一種非常具有潛力的技術，ips細胞的出現，為軟骨損傷和缺損的提供了新的途徑。但是目前的利用ips細胞分離培養人軟骨組織的條件十分復雜，且細胞誘導的形成效率低。
技術實現要素：
5.針對上述情況，為彌補上述現有缺陷，本發明提供了一種可以有效提高分化效率的體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法。
6.本發明提供如下的技術方案：本發明提出的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，具體包括下列步驟：
7.(1)取ips細胞接種到盛有dmem培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；
8.(2)將第一代細胞置于培養基a上培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％co2，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞；
9.(3)將第二代細胞按照5
×
104～9
×
104個細胞/cm2的個數接種到培養基b上進行培養，培養基b誘導第二代細胞生產細胞微團；
10.(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基c上進行誘導培
養，誘導培養時間為20～23天即可分化生成軟骨組織，每隔3天更換一次培養基c。
11.進一步地，所述培養基a以無血清培養基為基礎培養基，還包括：質量濃度為8～15％的胎牛血清，100～120u/ml的氨芐青霉素濃度、50～100u/ml的鏈霉素雙抗，8～13μg/l的成纖維細胞生長因子，5～8mg/l的阿米卡星。
12.進一步地，所述培養基b以高糖dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為6～12％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰島素、65～85μmol/ml的地塞米松、6.8～9.2mg/ml的轉鐵蛋白、20～35mg/ml的抗壞血酸和0.8～1.2μmol/mlbmp7。
13.進一步地，所述培養基c以dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為5～10％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰島素、95～110μmol/ml的地塞米松、4.2～6.6mg/ml的轉鐵蛋白、20～35mg/ml抗壞血酸、10～50ng/ml轉化生長因子β1、10～35ng/ml的tgf-β劑、20～50mg/ml的1，25-二羥基維生素d3和20～50mg/ml的atst-trin蛋白和5～10ng/ml的dapt。
14.采用上述結構本發明取得的有益效果如下：本發明提出的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，通過培養基a、培養基b和培養基c的定向誘導，有效的提高了ips細胞定向分化效率，從而增高了軟骨組織的形成率。
具體實施方式
15.下面將結合本發明的實施例，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例；基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
16.實施例1
17.本發明提供如下的技術方案：本發明提出的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，具體包括下列步驟：
18.(1)取ips細胞接種到盛有dmem培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；
19.(2)將第一代細胞置于培養基a上培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％co2，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞，所述培養基a以無血清培養基為基礎培養基，還包括：質量濃度為11.5％的胎牛血清，110u/ml的氨芐青霉素濃度、75u/ml的鏈霉素雙抗，10.5μg/l的成纖維細胞生長因子，6.5mg/l的阿米卡星；
20.(3)將第二代細胞按照5
×
104～9
×
104個細胞/cm2的個數接種到培養基b上進行培養，培養基b誘導第二代細胞生產細胞微團，所述培養基b以高糖dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為9％的胎牛血清、3.75mg/ml的胰島素、75μmol/ml的地塞米松、8mg/ml的轉鐵蛋白、27.5mg/ml的抗壞血酸和1.0μmol/mlbmp7；
21.(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基c上進行誘導培養，誘導培養時間為20～23天即可分化生成軟骨組織，每隔3天更換一次培養基c，所述培養基c以dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為7.5％的胎牛血清、3.75mg/ml的胰島素、102.5μmol/ml的地塞米松、5.4mg/ml的轉鐵蛋白、27.5mg/ml抗壞血酸、30ng/ml轉化生長因子β1、22.5ng/ml的tgf-β劑、35mg/ml的1，25-二羥基維生素d3和35mg/ml的atst-trin蛋白
和7.5ng/ml的dapt。
22.實施例2
23.本發明提供如下的技術方案：本發明提出的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，具體包括下列步驟：
24.(1)取ips細胞接種到盛有dmem培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；
25.(2)將第一代細胞置于培養基a上培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％co2，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞，所述培養基a以無血清培養基為基礎培養基，還包括：質量濃度為8％的胎牛血清，100u/ml的氨芐青霉素濃度、50u/ml的鏈霉素雙抗，8μg/l的成纖維細胞生長因子，5mg/l的阿米卡星；
26.(3)將第二代細胞按照5
×
104～9
×
104個細胞/cm2的個數接種到培養基b上進行培養，培養基b誘導第二代細胞生產細胞微團，所述培養基b以高糖dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為6％的胎牛血清、3.5mg/ml的胰島素、65μmol/ml的地塞米松、6.8mg/ml的轉鐵蛋白、20mg/ml的抗壞血酸和0.8μmol/mlbmp7；
27.(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基c上進行誘導培養，誘導培養時間為20～23天即可分化生成軟骨組織，每隔3天更換一次培養基c，所述培養基c以dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為5％的胎牛血清、3.5mg/ml的胰島素、95μmol/ml的地塞米松、4.2mg/ml的轉鐵蛋白、20mg/ml抗壞血酸、10ng/ml轉化生長因子β1、10ng/ml的tgf-β劑、20mg/ml的1，25-二羥基維生素d3和20mg/ml的atst-trin蛋白和5ng/ml的dapt。
28.實施例3
29.本發明提供如下的技術方案：本發明提出的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，具體包括下列步驟：
30.(1)取ips細胞接種到盛有dmem培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；
31.(2)將第一代細胞置于培養基a上培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％co2，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞，所述培養基a以無血清培養基為基礎培養基，還包括：質量濃度為15％的胎牛血清，120u/ml的氨芐青霉素濃度、100u/ml的鏈霉素雙抗，13μg/l的成纖維細胞生長因子，8mg/l的阿米卡星；
32.(3)將第二代細胞按照5
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104～9
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104個細胞/cm2的個數接種到培養基b上進行培養，培養基b誘導第二代細胞生產細胞微團，所述培養基b以高糖dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為12％的胎牛血清、4mg/ml的胰島素、85μmol/ml的地塞米松、9.2mg/ml的轉鐵蛋白、35mg/ml的抗壞血酸和1.2μmol/mlbmp7；
33.(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基c上進行誘導培養，誘導培養時間為20～23天即可分化生成軟骨組織，每隔3天更換一次培養基c，所述培養基c以dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為10％的胎牛血清、4mg/ml的胰島素、110μmol/ml的地塞米松、6.6mg/ml的轉鐵蛋白、35mg/ml抗壞血酸、50ng/ml轉化生長因子β1、35ng/ml的tgf-β劑、50mg/ml的1，25-二羥基維生素d3和50mg/ml的atst-trin蛋白和10ng/ml的dapt。
34.要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關系術語僅僅用來將一個實體
或者操作與另一個實體或操作區分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關系或者順序。而且，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物料或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物料或者設備所固有的要素。
35.盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。
技術特征：
1.一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，其特征在于，具體包括下列步驟：(1)取ips細胞接種到盛有dmem培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；(2)將第一代細胞置于培養基a上培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％co2，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞；(3)將第二代細胞按照5
×
104～9
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104個細胞/cm2的個數接種到培養基b上進行培養，培養基b誘導第二代細胞生產細胞微團；(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基c上進行誘導培養，誘導培養時間為20～23天即可分化生成軟骨組織，每隔3天更換一次培養基c。2.根據權利要求1所述的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，其特征在于，所述培養基a以無血清培養基為基礎培養基，還包括：質量濃度為8～15％的胎牛血清，100～120u/ml的氨芐青霉素濃度、50～100u/ml的鏈霉素雙抗，8～13μg/l的成纖維細胞生長因子，5～8mg/l的阿米卡星。3.根據權利要求1所述的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，其特征在于，所述培養基b以高糖dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為6～12％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰島素、65～85μmol/ml的地塞米松、6.8～9.2mg/ml的轉鐵蛋白、20～35mg/ml的抗壞血酸和0.8～1.2μmol/mlbmp7。4.根據權利要求1所述的一種體外誘導ips細胞分化生成人軟骨組織的方法，其特征在于，所述培養基c以dmem為基礎培養基，還包括：質量濃度為5～10％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰島素、95～110μmol/ml的地塞米松、4.2～6.6mg/ml的轉鐵蛋白、20～35mg/ml抗壞血酸、10～50ng/ml轉化生長因子β1、10～35ng/ml的tgf-β劑、20～50mg/ml的1，25-二羥基維生素d3和20～50mg/ml的atst-trin蛋白和5～10ng/ml的dapt。
技術總結
本發明公開了一種體外誘導IPS細胞分化生成人軟骨組織的方法，具體包括下列步驟：(1)取IPS細胞接種到盛有DMEM培養液的細胞培養瓶中貼壁培養1天，待細胞貼壁后用胰蛋白酶消化離心，得到第一代細胞；(2)將第一代細胞置于培養基A上培養，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞；(3)將第二代細胞接種到培養基B上進行培養，培養基B誘導第二代細胞生產細胞微團；(4)將細胞微團轉移到離心管中，離心，棄上清，之后接種到培養基C上進行誘導培養。本發明涉及軟骨細胞分化技術領域，具體提供了一種可以有效提高分化效率的體外誘導IPS細胞分化生成人軟骨組織的方法。骨組織的方法。
