一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法
1.本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法。
背景技術：
2.雙歧桿菌是法國學者tissier首次從母乳喂養的嬰兒糞便中分離得到的，經過國內外許多學者研究發現雙歧桿菌可以促進人體發育，提高人體免疫力，減緩衰老和抗腫瘤等方面充當重要角，在維持腸道微生態平衡中起著至關重要的作用，并發揮多種益生效果。其中，長雙歧桿菌是在嬰兒糞便和成人的腸道微生物中發現先的最常見的雙歧桿菌物種，在人體健康中也發揮著重要作用，例如調節腸道平衡、便秘、降低膽固醇、抑制腸道中病原菌的生長等的生理功能。
3.雖然長雙歧桿菌菌體及代謝產物已廣泛應用于各個領域，包括食品、保健品、化妝品等，但由于長雙歧桿菌對氧極為敏感，在有氧條件下容易失活，很難進行有氧發酵。要實現其大規模發酵培養，就需要嚴格控制環境中的含氧量，這就大大提高了工業化規模發酵雙歧桿菌制品的困難，并且人體內的長雙歧桿菌必須要達到一定數量之后，才能發揮其益生作用，產品中的長雙歧桿菌在活菌數必須達到在106cfu/ml以上。因此，如何提高產品中長雙歧桿菌活菌數，確保其能夠人體腸道內定殖從而發揮益生作用成為目前較為重要的待解決的問題。
4.其中，一些研究人員針對上述問題進行了研究，例如專利cn102021162a公開了一種高活性雙歧桿菌菌粉的制備方法，該專利制成的雙歧桿菌菌粉活菌含量高，并且耐胃酸和膽鹽能力強，可以有效定殖腸道發揮療效，其中長雙歧桿菌的發酵液可達1.5
×
10
10
cfu/ml。但是，其發酵培養控制條件是在厭氧狀態下進行的，大大提高了工業生產的成本，加大了操作和工業化大規模發酵的難度。而專利cn1114354公開了一種雙歧桿菌在中藥培養基有氧發酵的方法，改變雙歧桿菌過去的厭氧發酵為有氧發酵，菌株生長正常，減少了工業生產的投資，降低了生產成本。但是，其操作太過繁瑣，費時，經過有氧發酵后，活菌數仍然較低，僅為108cfu/ml。
技術實現要素：
5.本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法。
6.本發明的目的通過下述技術方案實現：
7.一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，是將長雙歧桿菌活化后連續傳代，取最后一次傳代的菌液依次在液深15～20cm、10～15cm、6～12cm的培養基中進行如下發酵培養；
8.(1)接種到a培養基中，密封完全狀態下，35～37℃發酵培養12～24h；
9.(2)接種到a培養基中，半密封狀態下，35～37℃發酵培養12～24h；
10.(3)接種到b培養基中，35～37℃有氧發酵培養12～24h；
11.上述操作視為一輪有氧發酵，如此重復5～10輪；
12.其中，所述的a培養基為含有2.0～10.0g/l麥角硫因提取液、0.2～1.0g/l維生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸鹽酸鹽的mrs培養基；
13.所述的b培養基為含有2.0～10.0g/l麥角硫因提取液和0.2～1.0g/l維生素c的mrs培養基。
14.優選的，所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法是將長雙歧桿菌活化后連續傳代5～10代，取最后一次傳代的菌液依次在液深16cm、13cm、10cm的培養基中進行所述發酵培養。
15.優選的，所述的密封完全狀態是指：接種到裝有a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟。
16.優選的，所述的半密封狀態是指：接種到裝有a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加一層滅菌液體石蠟。
17.優選的，所述的a培養基為含有2.0～7.0g/l麥角硫因提取液、0.2～0.8g/l維生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸鹽酸鹽的mrs培養基。
18.進一步優選的，所述的a培養基為含有7.0g/l麥角硫因提取液、0.8g/l維生素c和0.5g/l l-半胱氨酸鹽酸鹽的mrs培養基。
19.最優選的，所述的a培養基配方如下：以1l體系計，其含有葡萄糖15.0～25.0g、蛋白胨2.0～15.0g、酵母浸粉2.0～14.0g、牛肉浸膏5.0～15.0g、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.05～0.5g、磷酸氫二鉀1.0～5.0g、無水乙酸鈉2.0～10.0g、七水硫酸鎂0.1～0.5g、檸檬酸氫二銨1.0～5.0g、吐溫80 0.5～1.5ml、麥角硫因提取液2.0～10.0g維生素c 0.2～1.0g，ph6.4～7.2。
20.優選的，所述的b培養基為含有2.0～7.0g/l麥角硫因提取液和0.2～0.8g/l維生素c的mrs培養基。
21.進一步優選的，所述的b培養基為含有7.0g/l麥角硫因提取液和0.8g/l維生素c的mrs培養基。
22.最優選的，所述的b培養基配方如下：以1l體系計，其含有葡萄糖15.0～25.0g、蛋白胨2.0～15.0g、酵母浸粉2.0～14.0g、牛肉浸膏5～15g、磷酸氫二鉀1.0～5.0g、無水乙酸鈉2.0～10.0g、七水硫酸鎂0.1～0.5g、檸檬酸氫二銨1.0～5.0g、吐溫80 0.5～1.5ml、麥角硫因提取液2.0～10.0g、維生素c 0.2～1.0g，ph6.4～7.2。
23.優選的，所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法包括如下步驟：
24.步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
25.步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
26.步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cmb培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；
27.步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
28.步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
29.步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
30.步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
31.步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cma培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
32.步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cmb培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h。
33.優選的，所述的長雙歧桿菌活化的操作為：取長雙歧桿菌菌液在mrsc固體培養基平板上劃線分離，厭氧培養24～48h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中厭氧培養24～48h；取菌液按2～10％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代5～10代，得到活化的菌液。
34.進一步優選的，所述的長雙歧桿菌活化的操作為：取長雙歧桿菌菌液在mrsc固體培養基平板上劃線分離，厭氧培養32h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中厭氧培養24h；取菌液按5％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代6代，得到活化的菌液。
35.優選的，所述的麥角硫因提取液為靈芝的麥角硫因提取液。
36.進一步優選的，所述的麥角硫因提取液通過如下方法制備得到：
37.a.從靈芝種子液中吸取菌液至無菌含有玻璃珠psb培養基中，28
±
2℃，150
±
50r/min培養10
±
2天；
38.b.收取菌絲，沖洗，冷凍干燥36
±
5h；
39.b.準確稱取干燥后菌絲體0.1g，研磨粉碎，加入三級水10ml，300
±
50w超聲提取10
±
2min；提取后置于65
±
5℃水浴30
±
2min，使用過濾法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4
±
1℃靜置12
±
2h；將靜置后溶液常溫8000
±
100r/min，15
±
2min離心，取上清；使用氮吹儀，85
±
5℃，氮吹至4ml以下，使用三級水定容樣品至4ml；
40.c.取出預處理后大孔樹脂抽濾收集，向樣品液中加入1g，置于搖床30
±
2℃，150
±
50r/min震蕩4
±
2h，可得所述的麥角硫因提取液。
41.一種長雙歧桿菌，通過上述方法制備得到。
42.上述長雙歧桿菌在益生菌制品領域中的應用。
43.本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
44.(1)與現有的技術相比，本發明提供了一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，改變了長雙歧桿菌傳統厭氧發酵方式的同時，解決了長雙歧桿菌在有氧發酵時活菌數低的問題。gb7101-2015《食品安全國家標準飲料》中規定的活菌飲料中活菌數要大于106cfu/ml，而通過本發明長雙歧桿菌菌株在有氧條件下進行發酵，可達到10
10-10
11
cfu/ml之間，活菌數比國家標準至少高一萬倍，可大幅度減少工業化發酵成本，簡化生產流程。
45.(2)相對于傳統的長雙歧桿菌需要添加氮氣、二氧化碳等惰性氣體發酵而言，本發明方法無需添加額外的惰性氣體；同時相對于現有的長雙歧桿菌有氧發酵方法而言，操作
更簡單，耗時更短，大大降低了生產成本，簡化了工藝流程，有利于長雙歧桿菌的大規模工業化發酵生產，具有巨大的商業化應用價值。
46.(3)通過本發明方法馴化的長雙歧桿菌能夠在常規有氧環境下生長，在常規培養條件下活菌高于109cfu/ml。在實際應用過程中，能夠大幅降低對生產設備、產品包裝和消費過程的厭氧需求，在益生菌制品領域具有廣泛的應用前景。
附圖說明
47.圖1是實施例4獲得的長雙歧桿菌與空白對照組有氧發酵32h od
600
值的變化比較圖。
具體實施方式
48.下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
49.下述實施例中采用的長雙歧桿菌菌株購自加拿大拉曼公司，菌株編號為r175；
50.下述實施例中采用的麥角硫因提取液是從高產麥角硫因的靈芝菌株fq23(已在中國發明專利申請202010120380.8中公開)中提取所得，具體制備方法為：
51.(1)靈芝菌絲的培養：取靈芝種子液接種于含100ml psb培養基的250ml的三角瓶中，接種量為5％，置于搖床，28℃，150r/min培養10天。
52.(2)預處理大孔樹脂：稱取大孔樹脂nka-9適量，使用無水乙醇浸泡4h以上。使用三級水沖洗大孔樹脂至無明顯醇味，同時靜置后水呈澄清透明，抽濾收集大孔樹脂，使用1mhcl浸泡大孔樹脂4h以上。使用三級水沖洗大孔樹脂至沖洗液ph呈中性，抽濾收集大孔樹脂，使用1m naoh浸泡大孔樹脂4h以上。使用三級水沖洗大孔樹脂至沖洗液ph呈中性，抽濾收集大孔樹脂，加入一級水，于4℃保存。
53.(3)靈芝菌絲體收集及處理：搖瓶培養10天后使用紗布過濾收集菌絲，并用50ml蒸餾水沖洗，將菌絲移至培養皿中，冷凍干燥36h。稱取干燥后菌絲體0.1g(精確至萬分之一)，研磨粉碎，加入三級水10ml，300w超聲提取10min。提取后置于65℃水浴30min，使用過濾法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4℃靜置12h。
54.(4)將靜置后溶液常溫離心8000r/min，15min，取上清。使用氮吹儀，85℃，氮吹至4ml以下，使用三級水定容樣品至4ml，取出預處理后大孔樹脂抽濾收集，向樣品液中加入1g，置于搖床30℃，150r/min震蕩4h，可得提取純化后提取液。
55.1、配置，分裝100ml，加入20顆玻璃珠，115℃滅菌30min。從靈芝菌株平板上切取大小約為0.5
×
0.5cm的菌絲塊，接種至psb培養基中，控制接種量為5％，置于搖床，28℃，150r/min培養4天，獲得種子液。
56.2、從種子液中吸取菌液至新的已分裝好的無玻璃珠psb培養基中，控制每個菌株設置3平行。
57.實施例1
58.(1)長雙歧桿菌的培養：
59.菌株活化：在mrsc固體培養基平板上，將保存的長雙歧桿菌菌液劃線分離，厭氧培養32h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中并封加一層滅菌液體石
蠟，厭氧培養24h；按5％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代6代，得到活化的菌液。
60.(2)培養基的配制：
61.a培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液2.0ml、維生素c 0.2g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
62.b培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液2.0ml、維生素c 0.2g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
63.(3)長雙歧桿菌的有氧發酵：
64.步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
65.步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
66.步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cm b培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；
67.步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
68.步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
69.步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
70.步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
71.步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
72.步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
73.以上步驟1～9步視為一輪有氧發酵，如此馴化5輪。
74.發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數結果如表1所示。
75.取發酵結束后的長雙歧桿菌，按5％接種量，接種到裝有液深10cm的b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；培養基中，37℃有氧發酵18h，測od
600
值。
76.實施例2
77.(1)長雙歧桿菌的培養：
78.菌株活化：在mrsc固體培養基平板上，將保存的長雙歧桿菌菌液劃線分離，厭氧培養32h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中并封加一層滅菌液體石蠟，厭氧培養24h；按5％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代6代，得到活化的菌液。
79.(2)培養基的配制：
80.a培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸
鹽酸鹽0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液4.0ml，維生素c 0.5g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
81.b培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液4.0ml維生素c 0.5g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
82.(3)長雙歧桿菌的有氧發酵：
83.步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
84.步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
85.步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cm b培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；
86.步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
87.步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
88.步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
89.步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
90.步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
91.步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
92.以上步驟1～9步視為一輪有氧發酵，如此馴化5輪。
93.發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數結果如表1所示。
94.取發酵結束后的長雙歧桿菌，按5％接種量，接種到裝有液深10cm的b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；培養基中，37℃有氧發酵18h，測od
600
值。
95.實施例3
96.(1)長雙歧桿菌的培養：
97.菌株活化：在mrsc固體培養基平板上，將保存的長雙歧桿菌菌液劃線分離，厭氧培養32h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中并封加一層滅菌液體石蠟，厭氧培養24h；按5％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代6代，得到活化的菌液。
98.(2)培養基的配制：
99.a培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液6.0ml維生素c 0.8g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
100.b培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液6.0ml維生素c 0.8g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
101.(3)長雙歧桿菌的有氧發酵：
102.步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
103.步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
104.步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cm b培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；
105.步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
106.步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
107.步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
108.步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
109.步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
110.步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
111.以上步驟1～9步視為一輪有氧發酵，如此馴化5輪。
112.發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數結果如表1所示。
113.取發酵結束后的長雙歧桿菌，按5％接種量，接種到裝有液深10cm的b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；培養基中，37℃有氧發酵18h，測od
600
值。
114.實施例4
115.(1)長雙歧桿菌的培養：
116.菌株活化：在mrsc固體培養基平板上，將保存的長雙歧桿菌菌液劃線分離，厭氧培養32h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中并封加一層滅菌液體石蠟，厭氧培養24h；按5％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代6代，得到活化的菌液。
117.(2)培養基的配制：
118.a培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫801.0ml、麥角硫因提取液7.0ml維生素c 0.8g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
119.b培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、無水乙酸鈉5.0g、七水硫酸鎂0.2g、檸檬酸氫二銨2.0g、吐溫80 1.0ml、麥角硫因提取液7.0ml維生素c 0.8g，加水定容至1000ml，調節ph6.8，121℃滅菌15min。
120.(3)長雙歧桿菌的有氧發酵：
121.步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
122.步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
123.步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cm b培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；
124.步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
125.步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
126.步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
127.步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
128.步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；
129.步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；
130.以上步驟1～9步視為一輪有氧發酵，如此馴化5輪。
131.發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數結果如表1所示。
132.取發酵結束后的長雙歧桿菌，按5％接種量，接種到裝有液深10cm的b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；培養基中，37℃有氧發酵18h，測od
600
值。
133.取本實施例獲得的長雙歧桿菌，按2％接種量，接種到mrs培養基中，37℃有氧發酵，記錄32h內od
600
值變化，結果如圖1所示。對照組取的是原始長雙歧桿菌，按2％接種量，接種到mrs培養基中，37℃有氧發酵。從圖中可以看出本實驗所得的馴化后的菌株在有氧發酵時生長明顯優于空白對照組，且更快進入生長對數期。
134.對比例1
135.與實施例1相同，區別僅在于，a培養基和b培養基中只添加麥角硫因2.0g或者維生素0.2g。發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數。
136.對比例2
137.與實施例1相同，區別僅在于，a培養基和b培養基中只添加麥角硫因4.0g或者維生素0.5g。發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數。
138.對比例3
139.與實施例1相同，區別僅在于，a培養基和b培養基中只添加麥角硫因6.0g或者維生素0.8g。發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數。
140.對比例4
141.與實施例1相同，區別僅在于，a培養基和b培養基中只添加麥角硫因7.0g或者維生素0.8g。發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數。
142.對比例5
143.與實施例1相同，區別僅在于，a培養基和b培養基中未添加麥角硫因和維生素。發酵結束后，測量長雙歧桿菌活菌數。
144.實施例1-4和對比例1-5的長雙歧桿菌活菌數測量結果如下表1所示：
145.表1.長雙歧桿菌活菌數測量結果
[0146][0147][0148]
實施例1-4和對比例1、5的長雙歧桿菌有氧發酵18h od
600
值如下表2所示：
[0149]
表2.長雙歧桿菌有氧發酵18h od
600
值
[0150][0151]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受所述的實施例
的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：將長雙歧桿菌活化后連續傳代，取最后一次傳代的菌液依次在液深15～20cm、10～15cm、6～12cm的培養基中進行如下發酵培養：(1)接種到a培養基中，密封完全狀態下，35～37℃發酵培養12～24h；(2)接種到a培養基中，半密封狀態下，35～37℃發酵培養12～24h；(3)接種到b培養基中，35～37℃有氧發酵培養12～24h；上述操作視為一輪有氧發酵，如此重復5～10輪；其中，所述的a培養基為含有2.0～10.0g/l麥角硫因提取液、0.2～1.0g/l維生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸鹽酸鹽的mrs培養基；所述的b培養基為含有2.0～10.0g/l麥角硫因提取液和0.2～1.0g/l維生素c的mrs培養基。2.根據權利要求1所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法是將長雙歧桿菌活化后連續傳代5～10代，取最后一次傳代的菌液依次在液深16cm、13cm、10cm的培養基中進行所述發酵培養。3.根據權利要求1或2所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的密封完全狀態是指：接種到裝有a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟；所述的半密封狀態是指：接種到裝有a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加一層滅菌液體石蠟。4.根據權利要求1或2所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的a培養基為含有2.0～7.0g/l麥角硫因提取液、0.2～0.8g/l維生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸鹽酸鹽的mrs培養基；所述的b培養基為含有2.0～7.0g/l麥角硫因提取液和0.2～0.8g/l維生素c的mrs培養基。5.根據權利要求1或2所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法包括如下步驟：步驟1：取最后一次傳代的菌液按照5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；步驟2：按5％的接種量接種到裝有液深16cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；步驟3：按5％的接種量接種到裝有液深16cmb培養基的螺口試管中，37℃有氧發酵18h；步驟4：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；步驟5：按5％的接種量接種到裝有液深13cm a培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；步驟6：按5％的接種量接種到裝有液深13cm b培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h；步驟7：按5％的接種量接種到裝有液深10cm a培養基的螺口試管中，擰緊蓋子，并封加一層滅菌液體石蠟，密封完全狀態下37℃發酵培養18h；
步驟8：按5％的接種量接種到裝有液深10cma培養基的螺口試管中，擰松蓋子，不封加液體石蠟，半密封狀態下35℃發酵培養18h；步驟9；按5％的接種量接種到裝有液深10cmb培養基的螺口試管中，35℃有氧發酵18h。6.根據權利要求1或2所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的長雙歧桿菌活化的操作為：取長雙歧桿菌菌液在mrsc固體培養基平板上劃線分離，厭氧培養24～48h，待平板上長出單菌落，將單菌落接種在mrsc液體培養基中厭氧培養24～48h；取菌液按2～10％的接種量進行傳代，厭氧條件下，反復傳代5～10代，得到活化的菌液。7.根據權利要求1或2所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的麥角硫因提取液為靈芝的麥角硫因提取液。8.根據權利要求7所述的長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法，其特征在于：所述的麥角硫因提取液通過如下方法制備得到：a.從靈芝種子液中吸取菌液至無菌含有玻璃珠psb培養基中，28
±
2℃，150
±
50r/min培養10
±
2天；b.收取菌絲，沖洗，冷凍干燥36
±
5h；b.準確稱取干燥后菌絲體0.1g，研磨粉碎，加入三級水10ml，300
±
50w超聲提取10
±
2min；提取后置于65
±
5℃水浴30
±
2min，使用過濾法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4
±
1℃靜置12
±
2h；將靜置后溶液常溫8000
±
100r/min，15
±
2min離心，取上清；使用氮吹儀，85
±
5℃，氮吹至4ml以下，使用三級水定容樣品至4ml；c.取出預處理后大孔樹脂抽濾收集，向樣品液中加入1g，置于搖床30
±
2℃，150
±
50r/min震蕩4
±
2h，可得所述的麥角硫因提取液。9.一種長雙歧桿菌，其特征在于：通過權利要求1-8任一項中所述的方法制備得到。10.權利要求9中所述的長雙歧桿菌在益生菌制品領域中的應用。
技術總結
本發明公開了一種長雙歧桿菌的高活菌數有氧發酵方法。該方法在改變了長雙歧桿菌傳統厭氧發酵方式的同時，解決了長雙歧桿菌在有氧發酵時活菌數低的問題。通過本發明長雙歧桿菌菌株在有氧條件下進行發酵，可達到10
