聚醚醚酮在作為DA合成載體中的應(yīng)用的制作方法
聚醚醚酮在作為dna合成載體中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及聚醚醚酮在作為dna合成載體中的應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
2.目前，dna的化學(xué)合成主要有固相合成法和液相合成法；固相合成法通常采用亞 磷酸酰胺三脂法進(jìn)行dna合成。基于固相亞磷酸酰胺三脂法的dna化學(xué)合成具體為： 第一步，連接在固相載體上，5’端羥基被二甲氧基三苯甲基(dmt)保護(hù)的核苷酸(通常 包含在一個(gè)合成柱內(nèi))通過(guò)加入三而去保護(hù)，從而獲得游離的5'-羥基端，以供 下一步合成反應(yīng)，使dna鏈在原有基礎(chǔ)上增加一個(gè)單體。第二步，將亞磷酰胺單體 與四氮唑活化劑混合進(jìn)入合成柱，形成亞磷酸酰胺四唑活性中間體(其5'端仍受dmt 保護(hù)，3'端被活化)。第三步，在序列中與先前連接在固相載體上核苷的5'-羥基發(fā)生 偶聯(lián)反應(yīng)、形成亞磷酸三酯，從而使合成序列鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基。第四步，采用碘 的四氫呋喃溶液將不穩(wěn)定，易被酸、堿水解亞磷酸酯鍵，轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的五價(jià)磷酸酯鍵。 經(jīng)過(guò)上述同樣的循環(huán)步驟，即可得到存儲(chǔ)所需的dna文本樣品。簡(jiǎn)而言之，基于固 相亞磷酸酰胺三脂法的dna化學(xué)合成由四個(gè)反應(yīng)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)完成一個(gè)單體的 合成，也就是說(shuō)每增加一個(gè)循環(huán)，即在固體載體上不斷增長(zhǎng)的寡核苷酸鏈上增加一個(gè) 堿基。
3.文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于dna合成載體的報(bào)道主要集中在控孔玻璃(cpg)、聚苯乙烯、以及 改性玻璃和改性硅片，由此可見對(duì)于dna合成載體的種類選擇存在較大的局限性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
4.為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種新的dna合成載 體。
5.為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)手段：
6.聚醚醚酮在作為dna合成載體中的應(yīng)用，其中，所述聚醚醚酮為經(jīng)化學(xué)修飾的聚 醚醚酮，具有以下式i所示的結(jié)構(gòu)式：
[0007][0008]
式中，n為200-500之間的整數(shù)，linker的結(jié)構(gòu)如下：
[0009][0010]
r為烷基、苯基或取代的苯基。
[0011]
優(yōu)選地，所述經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮的制備方法包括以下步驟：
[0012]
s1，羥基修飾：以二甲基亞砜為溶劑，硼氫化鈉為還原劑，在100-140℃下與聚 醚醚酮反應(yīng)3h，通過(guò)硼氫化鈉將聚醚醚酮中的醛基還原得到羥基修飾的聚醚醚酮，以 便進(jìn)一步修飾得到目標(biāo)產(chǎn)物；
[0013]
s2，異氰酸酯基團(tuán)修飾：以甲苯為溶劑，三乙烯二胺為堿，將步驟s1所得的羥 基修飾的聚醚醚酮與4，4-二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯在室溫下氮?dú)夥諊蟹磻?yīng)3天， 通過(guò)羥基與其中一個(gè)異氰酸酯基反應(yīng)，得到異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮，以便進(jìn)一 步修飾得到目標(biāo)產(chǎn)物；
[0014]
s3，氨基修飾：在室溫條件下，將步驟s2所得的經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚 酮與氫氧化鈉在1，4-二氧六環(huán)中反應(yīng)，通過(guò)氫氧化鈉與異氰酸酯基作用，脫去二氧 化碳得到氨基修飾的聚醚醚酮，以便進(jìn)一步修飾得到目標(biāo)產(chǎn)物；
[0015]
s4，linker接枝：在室溫下，將步驟s3所得的經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮與linker 在含有2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二異丙基乙胺 的乙腈溶液中反應(yīng)過(guò)夜，得到linker接枝的聚醚醚酮。
[0016]
優(yōu)選地，步驟s1中，所述聚醚醚酮的表面積為200cm2。
[0017]
優(yōu)選地，步驟s1中，聚醚醚酮、硼氫化鈉與二甲基亞砜按質(zhì)量體積比如下：聚 醚醚酮：硼氫化鈉：二甲基亞砜＝0.5g:0.1g:50ml。
[0018]
優(yōu)選地，步驟s2中，三乙烯二胺、羥基修飾的聚醚醚酮、4，4-二環(huán)己基甲烷二 異氰酸酯與甲苯按質(zhì)量體積比如下：羥基修飾的聚醚醚酮：三乙烯二胺：4，4-二環(huán)己 基甲烷二異氰酸酯：甲苯＝0.5g:2.15mg:1ml:19ml。
[0019]
優(yōu)選地，步驟s3中，經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮、氫氧化鈉與1，4-二氧六 環(huán)按質(zhì)量比如下：經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮：氫氧化鈉：1，4-二氧六環(huán)＝0.5:1:1。
[0020]
優(yōu)選地，步驟s4中，經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮、linker、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n, n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二異丙基乙胺和乙腈按質(zhì)量體積比如下：經(jīng)氨基修 飾的聚醚醚酮：linker：2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯：n,n
??
二異丙基乙胺：乙腈＝500mg:200mg:160mg:400ul。
[0021]
一種dna的合成方法，包括利用所述的經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮作為dna合成載 體進(jìn)行dna合成的步驟。
[0022]
具體如下：采用abi 8909dna合成儀，將經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮置于魯爾接頭 中，設(shè)置tca法亞磷酰胺合成程序，進(jìn)行自動(dòng)dna合成。
[0023]
其中，合成程序如下：
[0024][0025][0026]
本發(fā)明的有益效果
[0027]
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0028]
本發(fā)明所提供的經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮可以作為dna合成載體用于dna合成， 豐富了dna合成載體材料的種類。本發(fā)明所提供的dna合成載體為經(jīng)化學(xué)修飾的聚 醚醚酮，所用聚醚醚酮廉價(jià)易得，制備方法簡(jiǎn)單。并且本發(fā)明所提供的dna合成載 體的可設(shè)計(jì)性強(qiáng)，可
述例子中披露的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的可以用于實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)，因此可以視為實(shí) 施本發(fā)明的優(yōu)選方案。但是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書應(yīng)該明白，這里所公開 的特定實(shí)施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者類似的結(jié)果，而非背離本發(fā)明 的精神或范圍。
[0039]
除非另有定義，所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語(yǔ)，和本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù) 人員所通常理解的意思相同，在此公開引用及他們引用的材料都將以引用的方式被并 入。
[0040]
那些本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將意識(shí)到或者通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)就能了解許多這里所描述的 發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等同技術(shù)。這些等同將被包含在權(quán)利要求書中。
[0041]
1,4-二氧六環(huán)、三乙烯二胺、n,n-二異丙基乙胺、二甲基亞砜、硼氫化鈉、4,4
??
二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯、 氫氧化鈉、二甲苯、dna合成用脫帽劑、活化劑、氧化劑、蓋帽劑及a、t、g、c 單體一般采用市售產(chǎn)品，都能從市場(chǎng)上方便得到。
[0042]
實(shí)施例1
[0043]
本實(shí)施例在于提供經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮，具有以下式i所示的結(jié)構(gòu)式：
[0044][0045]
式中，r為苯基(-ph)，n為400
[0046]
本實(shí)施例還提供經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0047]
s1，制備羥基修飾的聚醚醚酮：在20ml的圓底瓶中加入10ml二甲基亞砜(dsmo) 和0.05g硼氫化鈉(nabh4)，在120℃的條件下加熱至完全溶解，而后將聚醚醚酮 (peek)材料(0.5g，200cm2)完全浸沒(méi)于120℃的反應(yīng)溶液中反應(yīng)3小時(shí)。待反應(yīng) 結(jié)束后，將peek材料從圓底瓶中取出，依次用甲醇、去離子水、0.5mol/l鹽酸、去 離子水、乙醇分別沖洗三次，沖洗結(jié)束后將peek材料微孔板置于真空狀態(tài)在60℃的 條件下干燥3小時(shí)，即可達(dá)到相應(yīng)的羥基修飾的聚醚醚酮(peek)材料，反應(yīng)過(guò)程如下 式i所示：
[0048][0049]
s2，制備異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮：在氮?dú)鈼l件下，在密閉的反應(yīng)容器中加 入10ml二甲苯(dimethylbenzene)、0.5ml 4,4-二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯(hmdi) 和1.08g三乙烯二胺(dabco)充分?jǐn)嚢枞芙馔耆瑢⒉襟Es1所得的羥基修飾的聚 醚醚酮完全浸沒(méi)于攪拌后的反應(yīng)溶液中，于室溫下浸泡3天。反應(yīng)結(jié)束后，將聚醚醚 酮材料樣品在氮?dú)鈼l件下用二甲苯和1,4-二氧六環(huán)溶劑分別沖洗3次，即可得到異氰 酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮(peek-nco)。反應(yīng)過(guò)程如下式ii所示：
[0050][0051]
s3，制備氨基修飾的聚醚醚酮：在室溫條件下，將步驟s2所得的經(jīng)異氰酸酯基 團(tuán)修飾的聚醚醚酮浸沒(méi)于0.5mol/l氫氧化鈉(naoh)溶液和1,4-二氧六環(huán)(1,4-dioxane) 體積比1：1的混合溶液中，浸泡5小時(shí)。待反應(yīng)完成后，用去離子水和1,4-二氧六環(huán) 溶液分別沖洗三次。將沖洗后的材料置于真空狀態(tài)下干燥3小時(shí)，即可得到相應(yīng)的氨 基修飾的聚醚醚酮(peek-nh2)。反應(yīng)過(guò)程如下式iii所示：
[0052][0053]
s4，制備linker接枝的聚醚醚酮：在室溫下，在20ml的圓底瓶中分別加入100mg linker、80mg 2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、200ul n,n-二異丙基乙胺(n,n-diisopropylethylamine)和10ml乙腈(ch3cn)，搖勻。將步 驟s3所得的經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮置于圓底瓶中，攪拌過(guò)夜。反應(yīng)完成后，將材料 取出分別用乙腈和1,4-二氧六環(huán)沖洗三次，晾干，即可達(dá)到相應(yīng)的linker接枝修飾后 的聚醚醚酮(peek-linker)材料。反應(yīng)過(guò)程如下式iv所示：
[0054][0055]
實(shí)施例2
[0056]
本實(shí)施例在于提供實(shí)施例1所得的經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮在作為dna合成載體 中的應(yīng)用：
[0057]
(1)dna的合成：采用abi 8909dna合成儀，將實(shí)施例1所得的經(jīng)化學(xué)修飾 的聚醚醚酮置于魯爾接頭中，設(shè)置tca法亞磷酰胺合成程序，進(jìn)行自動(dòng)dna合成。
[0058]
其中，合成程序如下表1所示：
[0059]
表1，合成程序1
[0060]
[0061][0062]
(2)合成dna的后處理及質(zhì)檢
[0063]
合成結(jié)束后的peek材料從abi 8909dna合成儀上取出，放置于500μl氨水中 進(jìn)行脫保護(hù)和切割處理，70℃下2小時(shí)后取出。將氨水溶液吸出，加入1.5ml冰乙醇 溶液，加入50μl醋酸鈉(3m溶度)，待合成產(chǎn)物析出后，進(jìn)行6000g離心，棄上清。 加入80％乙醇水溶液，震蕩清洗沉淀物。再次離心后，重復(fù)清洗一遍。最終沉淀于60℃ 干燥5分鐘。干燥好的合成產(chǎn)物用10mm triscl溶液溶解，用nanodrop儀測(cè)得濃度為 15ng/μl，產(chǎn)物共120pmol。其page變性膠電泳法質(zhì)檢和hplc質(zhì)檢結(jié)果分別如圖1 和圖2所示。
[0064]
對(duì)比例1
[0065]
對(duì)比例1與實(shí)施例2相比，區(qū)別在于對(duì)比例1采用現(xiàn)有載體多空玻璃珠(cpg) 材料進(jìn)行dna合成，其合成產(chǎn)物用安捷倫2100生物分析質(zhì)檢結(jié)果如圖3所示。
[0066]
對(duì)比例2
[0067]
對(duì)比例2與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于對(duì)比例2采用未修飾的peek材料進(jìn)行dna 合成，結(jié)果如圖3所示(未修飾的peek材料，不能做為dna合成的載體)。
[0068]
對(duì)比例3
[0069]
對(duì)比例3與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于對(duì)比例2采用聚苯硫醚(pps)材料進(jìn)行dna 合成，結(jié)果如圖3所示(聚苯硫醚材料，不能做為dna合成的載體)。
[0070]
由圖2可知，未修飾的peek材料和聚苯硫醚材料均不能作偽dna合成的載體。
[0071]
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本技術(shù)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本技術(shù)所附權(quán)利要求書 所限定的范圍。
技術(shù)特征：
1.聚醚醚酮在作為dna合成載體中的應(yīng)用，其特征在于，所述聚醚醚酮為經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮，具有以下式i所示的結(jié)構(gòu)式：式中，n為200-500之間的整數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述聚醚醚酮在作為dna合成載體中的的應(yīng)用，其特征在于，所述經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮的制備方法包括以下步驟：s1，羥基修飾：以二甲基亞砜為溶劑，硼氫化鈉為還原劑，在100-140℃下與聚醚醚酮反應(yīng)3h得到羥基修飾的聚醚醚酮；s2，異氰酸酯基團(tuán)修飾：在室溫下，以甲苯為溶劑，三乙烯二胺為堿，將步驟s1所得的羥基修飾的聚醚醚酮與4，4-二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯在氮?dú)夥諊蟹磻?yīng)3天，得到異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮；s3，氨基修飾：在室溫條件下，將步驟s2所得的經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮與氫氧化鈉在1，4-二氧六環(huán)中反應(yīng)得到氨基修飾的聚醚醚酮；s4，linker接枝：在室溫下，將步驟s3所得的經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮與linker在含有2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二異丙基乙胺的乙腈溶液中反應(yīng)過(guò)夜，得到linker接枝的聚醚醚酮。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚醚醚酮在作為dna合成載體中的的應(yīng)用，其特征在于，步驟s1中，聚醚醚酮的表面積為200cm2。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚醚醚酮在作為dna合成載體中的的應(yīng)用，其特征在于，步驟s1中，所述聚醚醚酮、硼氫化鈉和二甲基亞砜按質(zhì)量體積比如下：聚醚醚酮：硼氫化鈉：二甲基亞砜＝0.5g:0.1g:50ml。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s2中，所述羥基修飾的聚醚醚酮、三乙烯二胺、4，4-二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯與甲苯按質(zhì)量體積比如下：羥基修飾的聚醚醚酮：三乙烯二胺：4，4-二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯：甲苯＝0.5g:2.15mg:1ml:19ml。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s3中，所述經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮、氫氧化鈉與1，4-二氧六環(huán)按質(zhì)量比如下：經(jīng)異氰酸酯基團(tuán)修飾的聚醚醚酮：氫氧化鈉：1，4-二氧六環(huán)＝0.5:1:1。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s4中，經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮、linker、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷所述酸酯、n,n-二異丙基乙胺和乙腈按質(zhì)量體積比如下：經(jīng)氨基修飾的聚醚醚酮：linker：2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’?
四甲基脲六氟磷酸酯：n,n-二異丙基乙胺：乙腈＝500mg:200mg:160mg:400ul。8.一種dna的合成方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求1所述的經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮作為載體進(jìn)行dna合成的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的dna的合成方法，其特征在于，所述方法具體如下：將所述經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮置于dna合成儀的魯爾接頭中，設(shè)置tca法亞磷酰胺合成程序，進(jìn)行自動(dòng)dna合成。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了聚醚醚酮在作為DA合成載體中的應(yīng)用，所述聚醚醚酮為經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮，具有以下式I所示的結(jié)構(gòu)式：式中，n為200-500之間的整數(shù)。本發(fā)明所提供的經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮可以作為DA合成載體用于DA合成，豐富了DA合成載體材料的種類。本發(fā)明所提供的DA合成載體為經(jīng)化學(xué)修飾的聚醚醚酮，所用聚醚醚酮廉價(jià)易得，制備方法簡(jiǎn)單。制備方法簡(jiǎn)單。
