一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針及其制備方法
1.本發明屬于熒光探針技術領域，涉及了一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針的制備方法；具體的，是涉及了一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針的光學性能。
背景技術：
2.活性氧物種(ros)指的是含氧的活性物質。每種ros的化學反應活性和存在時間都不同。其中，過氧化氫(h2o2)是其中一種較為活躍的活性氧，因其具有相對溫和的反應活性和較長的存在壽命而備受關注。據相關研究發現：體內的過氧化氫與細胞信號轉導具有密切相關性。活細胞中過氧化氫濃度的異常可能會導致一系列器官功能紊亂，從而會進一步加劇核酸的氧化損傷和蛋白質結構的改變，并最終導致人類衰老和各種與年齡相關的疾病，如心血管疾病、神經退行性疾病、糖尿病和癌癥等。
3.在目前已有的眾多檢測方法中，熒光探針法由于其響應快速和高靈敏度等能力，展現出了其他方法無法比擬的突出優勢，特別是近紅外(nir)熒光探針在用于活體成像時，因其有效的組織深度穿透能力和良好的信號可視比而備受歡迎。因此，發展一種低毒、高靈敏度、高選擇性的過氧化氫探針具有極其重要的現實意義。
技術實現要素：
4.針對上述問題，本發明提供了一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針，該熒光探針化合物對過氧化氫專一性識別，比率檢測并且靈敏度高。
5.本發明還提供了基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針的制備方法和性能。
6.本發明的技術方案是：本發明所述的一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針，所述熒光探針的結構式如式(ⅰ)所示：
[0007][0008]
進一步的，一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針的制備方法，其具體準備步驟如下：
[0009]
步驟(1)、將預備的間氨基苯酚通過環化反應得到中間體(ⅱ)；
[0010]
步驟(2)、再以中間體(ⅱ)和預備的4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯為原料，在有機溶劑中進行反應，最終制得熒光探針(ⅰ)，即過氧化氫小分子熒光探針。
[0011]
進一步的，在步驟(1)中，所述中間體(ⅱ)的具體制備步驟如下：
[0012]
首先，將預備的間氨基苯酚溶解在鹽酸中，從而制得含有間氨基苯酚的反應試劑；
[0013]
其次，在室溫攪拌下，將預制的四氯苯醌正丁醇溶液添加至上述反應試劑中，從而制得混合液。將制得的該反應混合液在攪拌中加熱至回流，之后并將預制的巴豆醛正丁醇溶液緩慢滴加到該攪拌的回流溶液中，滴加時間不少于30分鐘，添加完畢后，將該反應混合液再繼續回流反應2-4小時；
[0014]
隨后，反應完成后，待反應液冷卻至室溫后，再通過減壓蒸餾除去有機溶劑正丁醇，后將殘余物溶解到水中，并用乙醚萃取以除去殘余物中殘留的有機物；
[0015]
最后，將水層用10％naoh溶液中和后，再用乙酸乙酯萃取，合并的有機相用無水na2so4干燥后，減壓除去有機溶劑即得粗產品；將該粗產品再通過薄層譜柱提純，以制得純的中間體(ⅱ)。
[0016]
進一步的，所述間氨基苯酚與鹽酸的摩爾比是：1:3-4；
[0017]
所述四氯苯醌正丁醇溶液中四氯苯醌和正丁醇的摩爾比是：1:250-350；
[0018]
所述巴豆醛正丁醇溶液中巴豆醛和正丁醇的摩爾比是：1:1-5。
[0019]
進一步的，在步驟(2)中，所述熒光探針(ⅰ)的具體制備步驟如下：
[0020]
首先，將制備的中間體(ⅱ)、預備的4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯和碳酸鉀依次溶解于有機溶液乙腈中，回流攪拌；待反應結束后制得反應液；
[0021]
然后，將制得的反應液抽濾，將濾渣用乙腈洗滌后，放入真空干燥箱干燥后得到熒光探針(ⅰ)。
[0022]
進一步的，所述中間體(ⅱ)、4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯和碳酸鉀的摩爾比是：1:1.2:1.2。
[0023]
進一步的，一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針在檢測溶液過氧化氫中的應用。
[0024]
具體的，1、間氨基酚，是一種有機化合物，化學式為c6h7no，是一種重要的精細化工中間體，廣泛應用于醫藥、染料、農藥等行業。
[0025]
2、四氯苯醌，tetra-chloro-benzoquinone，又稱四氯對苯醌，四氯代醌，氯冉等；分子式c6cl4o2，分子量245.88；從乙酸或丙酮中析出者為金黃片狀結晶，從苯或甲苯中析出者或升華制得者為單斜晶系黃柱狀結晶；有令人不愉快的持久性氣味；有升華性。不溶于水，難溶于冷乙醇、冷石油醚，溶于乙醚、氯仿、四氯化碳和二硫化碳；緩慢溶于堿溶液，當有空氣存在時，生成紅棕至紫的沉淀(四氯對苯醌鉀)；可用作非內吸性殺菌劑，用于谷物、花生、蔬菜、棉花、豆類的種子殺菌，也可以用作染料中間體，農藥原料以及制革行業等。
[0026]
本發明的有益效果是：該探針通過醚鍵將喹啉和硼酸酯連接起來，避免了季銨鹽的形成而導致探針分子的分離純化困難和膜透性差的不足；所得產品為固體粉末，易于存儲，穩定性好；該探針分子與過氧化氫濃度均呈現良好的線性關系，r2＝0.996，檢測限低至1.447μmol/l，這一數值低于大部分喹啉系過氧化氫熒光探針。與包括活性氧分子、氨基酸和無機鹽在內的其他相關物種相比，該探針都對過氧化氫表現出優良的選擇性識別。
附圖說明
[0027]
圖1是本發明實施例中制得的過氧化氫熒光探針在0.1％dmso的pbs緩沖液(10mm,ph＝7.4)中對不同濃度過氧化氫(h2o2)的紫外吸收光譜圖；
[0028]
圖2是本發明實施例中制得的過氧化氫熒光探針在0.1％dmso的pbs緩沖液(10mm,
ph＝7.4)中對不同濃度過氧化氫(h2o2)的熒光光譜響應圖；
[0029]
圖3是本發明實施例中制得的熒光探針檢測過氧化氫時的響應時間圖；
[0030]
圖4是本發明實施例中制得的過氧化氫熒光探針在0.1％dmso的pbs緩沖液(10mm,ph＝7.4)中在不同ph下的熒光光譜響應圖；
[0031]
圖5是本發明實施例中制得的過氧化氫熒光探針在0.1％dmso的pbs緩沖液(10mm,ph＝7.4)中對相關物種選擇性的熒光光譜響應圖；
[0032]
圖6是本發明實施例中制得的熒光探針的質譜ms譜圖；
[0033]
圖7是本發明實施例中制得的熒光探針的核磁共振1h-nmr譜圖；
[0034]
圖8是本發明實施例中制得的熒光探針的核磁共振
13
c-nmr譜圖；
[0035]
圖9是本發明的具體制備反應路線圖。
具體實施方式
[0036]
為了更清楚地說明本發明的技術方案，下面結合附圖對本發明的技術方案做進一步的詳細說明：
[0037]
本發明的合成路線如下所示：
[0038][0039]
其中，中間體(ⅱ)為2-甲基-7-羥基喹啉，化合物(ⅰ)為本發明所述檢測過氧化氫熒光探針。
[0040]
進一步地，所述制備過程包括：
[0041]
(1)、制備中間體(ⅱ)：
[0042]
將間氨基苯酚溶解在12n鹽酸中，制得含有間氨基苯酚的反應試劑中；
[0043]
隨后依次將四氯苯醌正丁醇溶液添加到該試劑中，添加結束后，該混合液在105℃下回流；隨后在此溫度下，將預制的巴豆醛正丁醇溶液緩慢滴加到該攪拌的回流溶液中，添加完后再回流；反應完后通過減壓旋蒸除去有機溶劑正丁醇，后將殘余物溶解到水中并由乙醚洗滌，水層用10％naoh溶液中和后，用乙酸乙酯萃取，再通過薄層譜柱提純，得到中間體(ⅱ)；
[0044]
(2)、制備熒光探針(ⅰ)，即：基于喹啉的過氧化氫熒光探針化合物ⅰ：
[0045]
將制備的中間體(ⅱ)、預備的4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯和碳酸鉀依次溶解于有機
溶劑乙腈中，在80℃下回流攪拌；待反應結束后，將反應液抽濾，濾渣用乙腈洗滌后，放入真空干燥箱干燥后得到制備熒光探針(ⅰ)，即：基于喹啉的過氧化氫熒光探針化合物ⅰ。
[0046]
本發明所述的基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針在檢測溶液中過氧化氫的應用。
[0047]
本發明中使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。實驗所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例中所選用的以下所有試劑皆為市售分析純或化學純。
[0048]
實施例1
[0049]
一種基于喹啉設計的過氧化氫小分子熒光探針的制備方法，其制備方法：
[0050]
(1)、制備中間體(ⅱ)2-甲基-7-羥基喹啉
[0051]
首先，將間氨基苯酚(775.0mg,7.1mmol)溶解在12n hcl中，隨后依次將四氯苯醌(1.81g,7.1mmol)和正丁醇(2.5ml)添加到反應混合液中，添加結束后，反應混合液在105℃下回流；隨后在此溫度下，將巴豆醛(0.2ml)和正丁醇(0.2ml)的混合液在20min內滴加到反應液中，添加完后再回流30min；反應完后通過減壓旋蒸除去反應液中的正丁醇，后將殘余物溶解到水中并由乙醚洗滌，水層用10％naoh溶液中和后，用乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取，合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，再通過薄層譜柱提純(v
ea
:v
pe
＝3:2)，旋干，真空干燥得2-甲基-7-羥基喹啉(31.8mg，收率為20％)。
[0052]
所得中間體(ⅱ)的結構式為：
[0053][0054]
(2)、制備基于喹啉設計的過氧化氫熒光探針化合物：
[0055]
將2-甲基-7-羥基喹啉(159.2mg,0.2mmol)、4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯(71.3mg,0.24mmol)和碳酸鉀(33.2mg,0.24mmol)依次溶解于乙腈中，在80℃下回流12h；待反應結束后，將反應液抽濾，濾渣用乙腈(5ml
×
2)洗滌后，放入真空干燥箱干燥后得到基于喹啉設計的過氧化氫熒光探針化合物ⅰ，為白粉末(225.2mg，收率為60％)。
[0056]
所得到的熒光探針化合物結構式為：
[0057][0058]
本發明制得的過氧化氫熒光探針化合物1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.94(d,j＝8.3hz,1h),7.84(d,j＝8.1hz,2h),7.64(d,j＝8.9hz,1h),7.48(d,j＝8.2hz,2h),7.42(d,j＝2.5hz,1h),7.21(dd,j＝8.9,2.5hz,1h),7.13(d,j＝8.3hz,1h),5.21(s,2h),2.70(s,3h),1.34(s,12h).
13
c nmr(101mhz,chloroform-d)δ159.9,159.3,149.4,139.7,136.0,135.2(2c),128.7,126.8(2c),121.8,120.0,119.2,108.0,83.9(2c),77.4,70.0,25.4,25.0(4c).ms(api),m/z(％):calcd for c
23h26
bno3([m+h]
+
):376.3,found:376.2.
[0059]
實施例1中制得的熒光探針的質譜ms譜圖、核磁共振1h-nmr譜圖、核磁共振
13
c-nmr譜圖分別如圖6、圖7和圖8所示，說明本發明的熒光探針成功合成。
[0060]
實施例2
[0061]
將實施例1制得的過氧化氫檢測熒光探針用pbs緩沖液配置成1mm的探針儲備液，過氧化氫及相關對比物種用去離子水配置成3mm的儲備液，向3ml的0.1％dmso的pbs緩沖液中加入30μl的探針儲備液和100μl的過氧化氫儲備液并用熒光光譜儀和紫外分光光度計進行檢測，測試得知熒光探針的最大激發波長為242nm，最大發射波長為390nm，具體測試結果如下：
[0062]
取兩個比皿，分別加入3ml的0.1％dmso的pbs緩沖液和30μl的探針儲備液，向其中一個比皿加入0～100μl的過氧化氫儲備液，另外一個比皿不加過氧化氫儲備液，進行紫外光譜測試；如圖1所示，熒光探針本身在波長λ＝311nm處有較強的紫外吸收，當往溶液中加入過氧化氫后，紫外吸收峰漸漸的減弱；除此之外，熒光探針在波長λ＝390nm處幾乎沒有紫外吸收，當往溶液中增加過氧化氫濃度后，紫外吸收峰漸漸的增強；結果表明探針對h2o2具有很高的靈敏度。
[0063]
如圖2所述，該探針對不同濃度過氧化氫(h2o2)的熒光光譜響應圖；向3ml的0.1％dmso的pbs緩沖液中加入30μl的探針儲備液和0～100μl(0、10、20、30
……
90、100μl)的過氧化氫儲備液，該熒光探針在溶液中本身有熒光，隨著過氧化氫濃度的增加，在390nm處熒光不斷的減弱，在506nm處熒光不斷的增強，檢測限低至1.447μmol/l，r2＝0.996；說明該探針能夠進行比率檢測并且與過氧化氫濃度呈現良好的線性關系。
[0064]
如圖3所示，向3ml的0.1％dmso的pbs緩沖液中加入30μl的探針儲備液和100μl的過氧化氫儲備液，探針在390nm處的熒光強度逐漸降低，并且在40分鐘內達到穩定值。
[0065]
如圖4所示，加入3ml經過hcl和naoh調整后的ph為4、5、6、7、8、9、10的pbs緩沖液，再加入30μl探針和100μl過氧化氫儲備液；搖勻后靜置1h，測定其熒光強度；當探針與過氧化氫反應后，在ph＝4-8的范圍內熒光強度明顯降低，然后隨著ph繼續升高，發現熒光強度在ph＝8時達到最小值，之后在ph＝9-10內熒光強度有所回升，表明探針具備在弱堿性環境中檢測過氧化氫的能力。
[0066]
如圖5所示，該探針加入各種對比物種后的熒光光譜圖；向3ml的0.1％dmso的pbs緩沖液中加入30μl的探針儲備液和100μl的各種對比物種儲備液，結果表明加入過氧化氫時，熒光光譜在390nm處熒光強度發生了明顯的降低，而加入其他對比物種時，熒光無明顯變化，即本發明的熒光探針對過氧化氫有很好的選擇性。
[0067]
最后，應當理解的是，本發明中所述實施例僅用以說明本發明實施例的原則；其他的變形也可能屬于本發明的范圍；因此，作為示例而非限制，本發明實施例的替代配置可視為與本發明的教導一致；相應地，本發明的實施例不限于本發明明確介紹和描述的實施例。
