一株深海細菌新菌株及其應(yīng)用

本發(fā)明涉及一種海洋微生物新菌株及其應(yīng)用,具體涉及一株深海熱液羽流分離的 微生物新屬種及其應(yīng)用。

大洋中脊熱泉噴出的熱液進入海洋水體后，在熱浮力作用下迅速上升，并與周圍 海水混合，熱液組分濃度迅速稀釋至原有的10-4-10-5倍。混合后的流體在達到浮力平 衡前可上升數(shù)百米，同時發(fā)生側(cè)向擴散，其擴散范圍在空間尺度上可達數(shù)千公里，從 而形成熱液羽流（hydrothermal?plume）。熱液羽流在與周圍水體交換過程中形成各種 參數(shù)的梯度，其物理和化學(xué)特性與周圍海水區(qū)別鮮明，F(xiàn)e、Mn離子、甲烷、氫、硫化 氫等含量異常，與海洋其他生境（包括熱液口及其沉積物）相比，熱液羽流微生物的 研究工作相對較少。事實上分離自該環(huán)境的微生物往往具有一些特殊的生理生化特性， 并可能合成一些獨特的代謝產(chǎn)物提高菌株的環(huán)境適應(yīng)性，因此從該特殊環(huán)境中分離獲 得新的微生物資源一直是海洋微生物研究的熱點之一。

1999年，Yurkov等從太平洋熱液羽流采用酵母蛋白胨醋酸培養(yǎng)基 （yeast-peptone-acetate?medium）分離出需氧細菌Citromicrobium?bathyomarinum, 該菌能合成光合素；2005年，Beatty等通過在培養(yǎng)基中添加0.1%硫代硫酸鈉從深 海熱液羽流分離光合綠硫細菌,可以作為初級生產(chǎn)者參與能量循環(huán)。2008，Rathgeber 等采用酵母蛋白胨醋酸培養(yǎng)基添加1.5%(w/v)aCl從太平洋熱液羽流分離出需氧光 合細菌Erythrobacter。2010年，Dick等通過添加鐵錳元素從Guaymas?Basin深海熱 液羽流分離出八株Mn(Ⅱ)氧化細菌。在熱液羽流中還存在大量的自養(yǎng)硫氧化還原細 菌，它們通過氧化還原性硫獲得電子能量，作為生產(chǎn)者提供熱液區(qū)的生存能量。

可見深海熱液區(qū)水體中存在著大量的浮游微生物，它們具有重要的生態(tài)學(xué)意義， 這些微生物有望成為解決當(dāng)前人們所關(guān)注的醫(yī)藥、環(huán)保、能源等問題的重要資源。

本發(fā)明的一個目的是提供一種新的微生物菌種資源。

本發(fā)明所提供的微生物菌種資源是錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans），其 菌株號為8047，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號 為CGMCC?o.6697。

本發(fā)明的另一個目的是提供用錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047 CGMCC?o.6697制備四氫嘧啶的方法。

本發(fā)明所提供的制備四氫嘧啶的方法，包括如下步驟：從經(jīng)aCl誘導(dǎo)的錳氧化 黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697中提取四氫嘧啶。

其中，所述aCl誘導(dǎo)是在含有aCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)錳氧化黃氏菌（Huangia manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697。

所述含有aCl的培養(yǎng)基中aCl的含量大于0g/L，具體可為60g/L-90g/L。

在本發(fā)明的一個實施例中，采用含有6%（質(zhì)量百分含量）aCl的液體培養(yǎng)基對 錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697進行aCl誘導(dǎo)。在本 發(fā)明的另一個實施例中，采用含有9%（質(zhì)量百分含量）aCl的液體培養(yǎng)基對錳氧化黃 氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697進行aCl誘導(dǎo)。

所述含有aCl的培養(yǎng)基具體可為如下培養(yǎng)基：每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提 取物、60-90gaCl和余量的水制成。

上述方法中，培養(yǎng)錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697 具體可為在所述含有aCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans） 8047?CGMCC?o.6697?6-12小時，如8-10小時。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)四氫嘧啶菌劑。

本發(fā)明所提供的產(chǎn)四氫嘧啶菌劑含有錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans） 8047?CGMCC?o.6697。

本發(fā)明的錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697能在aCl 誘導(dǎo)條件下合成四氫嘧啶，隨著aCl濃度的增加其四氫嘧啶合成水平也相應(yīng)提高。

生物材料信息：

分類命名：錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）

菌株編號：8047

保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機構(gòu)簡稱：CGMCC

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2012年10月22日

保藏中心登記入冊編號：CGMCC?o.6697

下面結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。

圖1為錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697在不同鹽 濃度條件下四氫嘧啶合成水平的比較：A，四氫嘧啶標(biāo)品；B，60g/L?aCl條件下四氫 嘧啶的合成水平；C，90g/L?aCl條件下四氫嘧啶的合成水平。

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的分離 及鑒定

1、錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的分離

錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697分離自西南印度 洋2800米處熱液羽流海水樣品的海洋細菌。。它的分離方法如下：熱液羽流海水樣品 原位濃縮1000倍后取100ul涂布于YTSS培養(yǎng)基（每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提 取物、20gaCl、150g瓊脂和余量的水制成，pH為7.8）平板上于28℃培養(yǎng)，從中挑 取一株橙黃菌落的菌株，經(jīng)反復(fù)純化獲得錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans） 8047?CGMCC?o.6697。

2、錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的鑒定

1）形態(tài)特征：錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697在 YTSS培養(yǎng)基（每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、20gaCl、150g瓊脂和余量的水 制成，pH為7.8）中28℃培養(yǎng)28小時，菌體為桿狀，大小約1.8-2.0*0.9-1.2um， 側(cè)生單鞭毛，可運動。菌落呈黃，圓形隆起，不透明，邊緣整齊。

2）生理生化特征：

按照下述文獻中的方法測定了錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC o.6697的下述生理生化特征：《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠、蔡妙英等編著， 科學(xué)出版社，2001）中P353-386。

錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697為革蘭氏陰性菌， 氧化酶陽性，觸酶陽性，脲酶陽性，明膠液化實驗陽性，H2S實驗陽性，硝酸還原實驗 強陽性，脂酶陰性，淀粉利用陰性，纖維素利用陰性，甲基紅（M.R）實驗陰性，VP 實驗陰性，對慶大霉素(10ug/片)敏感，新霉素(30ug/片)敏感。其對不同碳源利用 的情況如表1所示。

表1.錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的碳源利用 結(jié)果

注：“+”表示能利用該碳源，“-”表示不能利用該碳源。

3）細胞組分：

按照下述文獻中的方法測定了錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC o.6697的下述細胞組分：《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠、蔡妙英等編著，科學(xué) 出版社，2001）中P391-398。

錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697細胞中主要的極 性脂組分為磷脂DPG,PG,PME,PE,PC，未知磷脂PL及未知糖脂GL；其呼吸醌為甲基萘 醌MK-6；其最主要的脂肪酸為C?18:1?w7c，占72.9%。

4）16S?rRA基因

錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的16S?rRA基因 序列如SEQ?ID?o.1所示，相似性比對結(jié)果顯示，與該菌株16S?rRA基因序列最相似 的是橙單胞菌科的闊海褐黃海水菌Fulvimarina?pelagi，但相似性僅有93%。

5）G＋Cmol%值

按照下述文獻中的方法測定了錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC o.6697的G＋Cmol%值：《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠、蔡妙英等編著，科學(xué)出 版社，2001）中P399-400。

錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的G+C?mol%含量 為61.7%。

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征、化學(xué)分類指標(biāo)以及16S?rRA基因序列分析，將錳 氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697定名為橙單胞菌科的新 屬種錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）。

實施例2、利用錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697 制備四氫嘧啶

四氫嘧啶的分子式為C6H102O2，結(jié)構(gòu)式如下：

四氫嘧啶能夠為處于極端（包括高溫、冷凍、射線、干燥以及高鹽等）環(huán)境下的 細胞提供保護作用，并對一些神經(jīng)性疾病有一定的療效，在精細化工、生物醫(yī)藥以及 生物制藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.aCl誘導(dǎo)錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697產(chǎn)四 氫嘧啶的發(fā)酵方法

本實驗采用以下兩種含有aCl的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)錳氧化黃氏菌（Huangia manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697：含有60g/L?aCl培養(yǎng)基和含有90g/L?aCl 培養(yǎng)基。其中，含有60g/L?aCl培養(yǎng)基每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、60g?aCl 和余量的水制成。含有90g/L?aCl培養(yǎng)基每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、90g aCl和余量的水制成。具體的培養(yǎng)方法如下：取斜面培養(yǎng)的錳氧化黃氏菌（Huangia manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697，分別接入上述含有60g/L?aCl培養(yǎng)基和含有 90g/L?aCl培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)8小時，6000rpm離心10min，收集沉淀得到菌體。

2.菌體四氫嘧啶提取方法

（1）取0.1g（濕重）菌體加入1ml甲醇/氯仿/水（體積比為10：5：4），劇烈震 蕩30min；

（2）離心13000rpm,10min促進分相；

（3）取上清液（800ul）再加入等體積的氯仿/水（體積分別為400ul和400ul）， 劇烈震蕩30min；

（4）離心13000rpm，再次離心分相，取500ul上清水相；

（5）凍干；

（6）溶于500ul?70%乙腈中，得到菌體細胞抽提液。

3.菌體四氫嘧啶的檢測及結(jié)果

（1）用有機濾器過濾步驟2得到的細胞抽提液，取150ul上樣。細胞抽提液用 反向氨基柱（H2?Analytical?HPLC?Column?4.6×250mm，購自安捷倫公司）進行HPLC 分離。流動相為70%乙腈，流速為1ml/min。檢測波長為210nm。

上述各實驗均設(shè)三次重復(fù)。結(jié)果表明采用含有60g/L?aCl培養(yǎng)基和含有90g/L aCl培養(yǎng)基培養(yǎng)的錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的 菌體細胞抽提液中均含有四氫嘧啶，采用含有60g/L?aCl培養(yǎng)基培養(yǎng)的錳氧化黃氏菌 （Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的菌體的四氫嘧啶產(chǎn)量為 0.005mg/109CFU，采用含有90g/L?aCl培養(yǎng)基培養(yǎng)的錳氧化黃氏菌（Huangia manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的菌體的四氫嘧啶產(chǎn)量為0.018mg/109CFU。說 明隨著aCl濃度的提高，錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697 合成四氫嘧啶水平也相應(yīng)提高。本實驗還設(shè)置了含有60g/L?aCl培養(yǎng)基和含有90g/L aCl培養(yǎng)基的空白對照，結(jié)果表明這兩種培養(yǎng)基中均不含有四氫嘧啶。圖1中A為作 為標(biāo)準(zhǔn)品的四氫嘧啶（Sigma公司產(chǎn)品編號：E2271）的HPLC圖譜，在上述譜條件 下其保留時間為13.1分鐘；圖1中B為采用含有60g/L?aCl培養(yǎng)基培養(yǎng)的錳氧化黃 氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697的菌體細胞抽提液的的HPLC圖 譜，該圖譜中含有保留時間為13.1分鐘的四氫嘧啶的層析峰；圖1中C為采用含有 90g/L?aCl培養(yǎng)基培養(yǎng)的錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697 的菌體細胞抽提液的HPLC圖譜，該圖譜中含有保留時間為13.1分鐘的四氫嘧啶的層 析峰。

另外，實驗證明錳氧化黃氏菌（Huangia?manganoxydans）8047?CGMCC?o.6697 在不含aCl的培養(yǎng)基中能生長，但是不能產(chǎn)生四氫嘧啶。