環肽化合物及其制備方法和抗病毒用途

本發明屬于醫藥生物領域中環肽化合物及其制備方法和抗病毒用途。

流感病毒是一種正黏液病毒科病毒，傳播速度快，傳染性強，每年都會引起季節性流行，患者被病毒感染后，輕微者表現出流鼻涕、高熱等癥狀，大多數患者還會引起呼吸道感染，表現出較為嚴重的肺炎癥狀，更嚴重的患者會出現心腎等多種臟器衰竭的情況，最終導致死亡。一些流感病毒對抗病毒藥物已經產生了抗藥性，限制了效果，研發具有新作用機制的抗甲型流感病毒(H11)的藥物迫在眉睫。丙型肝炎病毒(HCV)系黃病毒科肝炎病毒屬，是感染慢性肝病的主要病因之一，感染者有很高的風險發展為肝硬化甚至肝癌。雖然抗丙型肝炎病毒的一線藥物索非布韋等在丙肝的中發揮了重大作用，但由于其價格昂貴，耐藥等因素，依舊不能有效控制病毒感染，迫切需要價格合理，療效更高的抗丙型肝炎病毒(HCV)藥物。

植物內生放線菌由于與宿主植物的長期作用，可能具有獨特的次級代謝途徑，能夠產生化學結構與活性多樣性的產物。

本發明所要解決的技術問題是如何抗流感病毒和/或丙型肝炎病毒。

為了解決上述技術問題，本發明提供了環肽化合物或其藥學上可接受的鹽在制備病毒抑制劑或抗病毒藥物中的應用。

上述應用中，所述環肽化合物的結構式為式III：

南平霉素D的分子式為C35H439O9S，分子量為765；澤爾科瓦霉素的分子式為C36H459O9S，分子量為779。

本發明的環肽化合物或其藥學上可接受的鹽也屬于本發明的保護范圍。

本發明的環肽化合物可以以衍生自無機酸或有機酸的藥學可接受的鹽的形式使用。術語“藥學上可接受的鹽”指在可靠的醫學判斷范圍內，適合用于與人類和低等動物的組織接觸而不出現過度的毒性、刺激、過敏反應等，且與合理的效果/風險比相稱的鹽。藥學可接受的鹽是本領域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceut ical Sciences,1977,66:1中對藥學可接受的鹽進行了詳細描述。所述鹽可通過使本發明化合物的游離堿官能度與合適的有機酸反應來制備。

為了解決上述技術問題，本發明提供了病毒抑制劑或抗病毒藥物。

本發明所提供的病毒抑制劑或抗病毒藥物含有所述環肽化合物或其藥學上可接受的鹽。

上文中，所述病毒抑制劑或抗病毒藥物，除含有所述環肽化合物或其藥學上可接受的鹽外，還可含有藥學上可接受的載體。其中，藥學上可接受的載體以重量計可是所述病毒抑制劑或抗病毒藥物總重量的0.1-99.9％。

其中，藥學上可接受的載體包括微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素、甘露醇、山梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素A、維生素C、維生素E、維生素D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、β－環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和微晶中的一種或以上。

本發明的病毒抑制劑或抗病毒藥物，可以制備成任何要用劑型如片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、貼劑中的任意一種。

上述病毒抑制劑或抗病毒藥物的活性成分可為所述環肽化合物或其藥學上可接受的鹽，上述病毒抑制劑或抗病毒藥物的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，其他活性成分本領域技術人員可根據抗病毒的效果確定。

本發明還提供了南平霉素D的制備方法。

本發明所提供的南平霉素D的制備方法包括用培養基培養北里孢菌，得到發酵產物，從所述發酵產物中得到南平霉素D，所述北里孢菌可為北里孢菌(Kitasatospora sp.)

CPCC204717，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC o.20381。

本發明還提供了澤爾科瓦霉素的制備方法。

本發明所提供的澤爾科瓦霉素的制備方法包括用培養基培養北里孢菌，得到發酵產物，從所述發酵產物中得到澤爾科瓦霉素，所述北里孢菌可為北里孢菌(Kitasatosporasp.)CPCC204717，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC o.20381。

上述南平霉素D的制備方法和澤爾科瓦霉素的制備方法中，所述培養基可為放線菌培養基(能培養放線菌的培養基)，其可為固體培養基、半固體培養基或液體培養基。所述固體培養基選自：包括但不限于大米或以大米、小米、玉米、馬鈴薯為主要成分的固體培養基。所述放線菌培養基可為黃豆粉培養基、稻米培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基或其他本領域專業人員熟知的放線菌發酵培養基等。所述黃豆粉培養基可由黃豆粉、可溶性淀粉和水制成，也可由黃豆粉、可溶性淀粉、無機鹽和水制成，也可由黃豆粉、可溶性淀粉、無機鹽、水、氮源和無機鹽制成。所述稻米培養基可由稻米和水制成，也可由稻米、水和無機鹽制成，也可由稻米、水和氮源制成，也可由稻米、水、氮源和無機鹽制成。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基可由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂和水制成，也可由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、水和無機鹽制成，也可由馬鈴薯、碳源、瓊脂、水和氮源制成，也可由馬鈴薯、碳源、瓊脂、氮源和無機鹽制成。所述其他本領域專業人員熟知的真菌發酵培養基可由某一種或幾種速效、遲效碳源、某一種或幾種速效、遲效氮源、水和/或無機鹽等制成。碳源是微生物生長一類營養物，是含碳化合物，包括糖類、油脂、有機酸及有機酸酯和小分子醇等速效、遲效碳源。氮源是指提供微生物營養所需氮元素的物質，包括花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、銨鹽和硝酸鹽等速效、遲效氮源。

上述南平霉素D的制備方法和澤爾科瓦霉素的制備方法中，所述稻米可為大米或糙米。大米或糙米均是稻谷的制品。稻谷是指沒有去除水稻谷殼的果實，稻谷由谷殼、果皮、種皮、外胚乳、糊粉層、胚乳和胚構成。糙米是指稻谷脫去谷殼，保留稻谷其它各部分的制品；大米是指僅保留胚乳，而將稻谷其余部分全部脫去的制品。

上述南平霉素D的制備方法和澤爾科瓦霉素的制備方法可為液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素。上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述培養基可為液體培養基，所述發酵產物可為液體發酵產物。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，從所述發酵產物中得到南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素可包括(1)將所述液體發酵產物離心，得到上清液和菌絲體，所述上清液用大孔樹脂進行固相萃取，得到上清液提取物，所述菌絲體用溶劑超聲提取，得到菌絲體提取物；(2)將所述上清液提取物和所述菌絲體提取物合并，通過硅膠柱譜分離，用溶劑進行梯度洗脫，經凝膠柱層析分離，HPLC制備分離得到南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述液體培養基可選自：包括但不限于A1液體培養基。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，步驟(1)的溶劑可選自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類、丙酮、丁酮、或以上溶劑的混合溶液或以上溶劑與水的混合溶液；在本發明的一個實施例中為50％丙酮水溶液和/或丙酮。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，步驟(2)的溶劑溶液可選自：包括但不限于丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇中一種或以上混合；在本發明的一個實施例中為由二氯甲烷和甲醇組成的溶液。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述凝膠柱層析分離中所用的介質包括但不限于Sephadex LH-20、Tosoh Toyopearl HW-40；在本發明的一個實施例中為Sephadex LH-20。所用的流動相選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類、丙酮、丁酮、或以上溶劑的混合溶液或以上溶劑與水的混合溶液；在本發明的一個實施例中為，二氯甲烷-甲醇混合溶液以及甲醇。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述HPLC制備分離中所用的流動相可選自：丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液，在本發明的一個實施例中為乙腈水溶液，所述HPLC制備分離中所用的譜柱可包括但不限于C18譜柱、C8譜柱、C3譜柱和苯基鍵合柱。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述硅膠柱譜中所用的洗脫程序如下：1)先用100：1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫；2)接著用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫；3)接著用20：1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫；收集用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體，將該液體命名為餾分F2，和/或，收集用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體和用20：1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體，將該液體命名為餾分F3至F6。上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述制備方法包括從所述餾分F2中分離得到澤爾科瓦霉素，從所述餾分F3至F6中分離得到南平霉素D與澤爾科瓦霉素。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，從所述餾分F2中分離得到澤爾科瓦霉素可包括將所述餾分F2進行凝膠柱層析，所述凝膠柱層析中所用的介質可為Sephadex LH-20,所用的流動相可為1：1的二氯甲烷-甲醇溶液；將用所述流動相洗脫出的液體，命名為餾分F2-4，進行HPLC制備分離得到澤爾科瓦霉素。所述HPLC制備分離中所用的流動相可為乙腈和水體積比為40:60的組成的液體。

上述液體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，從所述餾分F3至F6中分離得到南平霉素D可包括將所述餾分F3至F6進行凝膠柱層析。所述凝膠柱層析中所用的介質可為Sephadex LH-20，所用的流動相可為甲醇。將用所述流動相洗脫出的液體，命名為餾分F3-2-F3-5，進行HPLC制備分離得到南平霉素D與澤爾科瓦霉素。所述HPLC制備分離中所用的流動相可為乙腈和水體積比為40:60組成的液體。

上述南平霉素D的制備方法和澤爾科瓦霉素的制備方法可為固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素。上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述培養基可為固體培養基，所述發酵產物可為固體發酵產物。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，從所述發酵產物中得到南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素可包括用有機溶劑提取所述固體發酵產物，得到提取物；將所述提取物進行C18反相閃式柱譜分離，用溶劑進行梯度洗脫，將洗脫得到的活性組分經凝膠柱層析分離，然后經HPLC制備分離得到南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述固體培養基可選自：包括但不限于大米或以大米、小米、玉米和/或馬鈴薯為主要成分的固體培養基。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，用有機溶劑提取所述固體發酵產物中，有機溶劑可選自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類、丙酮、丁酮、或以上溶劑的混合溶液。在本發明的一個實施例中為乙酸乙酯。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，將所述提取物可進行C18反相閃式柱譜分離，用溶劑進行梯度洗脫，所述溶劑可選自：包括但不限于丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇水溶液中一種或以上混合。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述凝膠柱層析分離中所用的介質包括但不限于Sephadex LH-20、Tosoh Toyopearl HW-40；在本發明的一個實施例中為Sephadex LH-20與Tosoh Toyopearl HW-40F。所述凝膠柱層析分離中所用的流動相有機溶劑可選自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類、丙酮、丁酮、水、或以上溶劑的混合溶液。在本發明的一個實施例中為甲醇水溶液。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述HPLC制備分離中所用的流動相可選自：丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液，在本發明的一個實施例中為甲醇水溶液。所述HPLC制備分離中所用的譜柱可包括但不限于C18譜柱、C8譜柱、C3譜柱和苯基鍵合柱。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述C18反相閃式柱譜分離中所用的流動相為甲醇水溶液，洗脫程序如下：1)先用10％的甲醇水溶液洗脫；2)接著用30％的甲醇水溶液洗脫；3)接著用50％的甲醇水溶液洗脫；4)接著用70％的甲醇水溶液洗脫，收集用70％的甲醇水溶液洗脫出的液體，將該液體命名為餾分F4。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，所述凝膠柱層析分離包括將所述餾分F4進行凝膠柱層析，所述凝膠柱層析中分離介質可為Sephadex LH-20，流動相可為80％的甲醇水溶液，將用所述流動相洗脫出的液體進行凝膠柱層析，所述凝膠柱層析中分離介質可為Toyopearl HW-40F，流動相可為70％甲醇-水溶液，收集洗脫出的液體，將該液體命名為餾分F4-4-3至F4-4-11。

上述固體發酵制備南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素中，對所述餾分F4-4-3至F4-4-11進行HPLC制備分離得到南平霉素D和澤爾科瓦霉素。所述HPLC制備分離中所用的流動相均可為60％甲醇水溶液。

上述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717也屬于本發明的保護范圍。

本發明還提供了抗病毒的菌劑。

本發明所提供的抗病毒的菌劑含有所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717或/和所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717的代謝物。

上述菌劑的活性成分可為所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717或/和所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717的代謝物，上述菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌劑的其他活性成分本領域技術人員可根據菌劑的抗病毒效果確定。

上文中，所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717的代謝物可為所述北里孢菌(Kitasatospora sp.)CPCC204717的發酵產物。

上文中，所述病毒可為下述至少一種：1)正黏液病毒科病毒，2)流感病毒，3)甲型流感病毒，4)黃病毒科病毒，5)肝炎病毒。

上文中，所述抗病毒藥物可為或/和預防由所述病毒所致疾病的藥物。

本發明中式I所示化合物南平霉素D抗甲型流感病毒(H11)以及抗丙型肝炎病毒(HCV)的EC50分別為0.3μM和3.2μM，其中抗甲型流感病毒(H11)病毒活性強于陽物利巴韋林近50倍，可用于甲型流感病毒(H11)以及丙型肝炎病毒(HCV)感染的。南平霉素D的抗H11型甲型流感病毒以及丙型肝炎病毒(HCV)活性顯著強于澤爾科瓦霉素(EC50分別為46.0μM和6.1μM)。南平霉素D和澤爾科瓦霉素為微生物發酵得到的天然產物，原料易得，因此可以作為抗甲型流感病毒(H11)以及丙型肝炎病毒(HCV)的先導化合物進行結構優化以開發活性更好的抗病毒藥物。以南平霉素D作為活性成分，與藥學上可接受的一種或多種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗甲型流感病毒(H11)或抗丙型肝炎病毒(HCV)的藥物組合物。南平霉素D及藥物組合物可用于甲型流感病毒(H11)以及丙型肝炎病毒(HCV)的臨床。南平霉素D和/或澤爾科瓦霉素也可與已知藥物組成復方制劑用于甲型流感病毒(H11)和丙型肝炎病毒(HCV)的。

保藏說明

菌種名稱：北里孢菌，拉丁名：Kitasatospora sp.，菌株編號：CPCC204717，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏機構簡稱：CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2020年07月16日，保藏中心登記入冊編號：CGMCCo.20381。

圖1為式I所示化合物的高分辨電噴霧質譜。

圖2為式I所示化合物的紅外光譜。

圖3為式I所示化合物的1H MR譜。

圖4為式I所示化合物的13C MR譜。

圖5為式I所示化合物的DEPT譜。

圖6為式I所示化合物的1H-1H COSY譜。

圖7為式I所示化合物的HSQC譜。

圖8為式I所示化合物的HMBC譜。

圖9為式I所示化合物的ROESY譜。

圖10為式Ⅱ所示化合物的高分辨電噴霧質譜。

圖11為式Ⅱ所示化合物的1H MR譜。

圖12為式Ⅱ所示化合物的13C MR譜。

圖13為式Ⅱ所示化合物的ROESY譜。

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。以下提供的實施例可作為本技術領域普通技術人員進行進一步改進的指南，并不以任何方式構成對本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

本發明實施方案適用于從任何微生物，而不限于從北里孢菌發酵產物中制備南平霉素D(nanpingmycin D)及其衍生物。以下所列實施例是為幫助本領域技術人員更好的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

實施例1、北里孢菌(Kitasatospora sp.)CGMCC o.20381的分離鑒定

1.菌株的分離：

北里孢菌菌株CPCC 204717(＝CGMCC o.20381)(Kitasatospora sp.CPCC204717)分離自蛇足石杉植株。蛇足石杉植株整棵植株采集后，次日帶回實驗室處理。流程如下：1)植株表面清洗：用緩流自來水沖洗植株表面；2)植株分割：用消過毒的枝剪將植株的地上部分和地下部分分割開，分別用于后續實驗；3)植物樣品表面消毒：首先，用無菌枝剪講植物樣品剪成大約10cm長短的節段，然后用依次用5％次氯酸鈉浸泡3min，75％酒精浸泡1min，75％酒精漂洗30s，無菌水沖洗3次，然后，用無菌吸水紙將植物樣品表面水分吸干；4)植物樣品的粉碎：將表面消過毒的植物節段放入無菌粉碎儀處理45s-1min，使植物樣品大部分呈碎屑狀，用于后續菌種分離。

菌種分離方法：在超凈工作臺中取植物碎屑均勻分撒在添加了50ppm的重鉻酸鉀和30ppm的制霉菌素的ISP2(國際鏈霉菌計劃2號培養基)分離培養基平板上,靜置于28℃恒溫培養箱，培養2周，挑取單菌落于新配置的ISP2平板上，劃線純化。把純化得到的菌株CPCC204717純菌種轉接于ISP2斜面培養基上，28℃恒溫培養7d后，長好后置4℃作短期保藏。

2.菌株的鑒定：

2.1形態特征

菌株CPCC204717在多數培養基上形成表面干燥的菌落，最大菌落直徑達1.5mm；氣生菌絲豐富，多呈絮狀，白至暗灰，分化成長孢子鏈狀，波曲；基內菌絲稀疏，不分枝，無斷裂，呈灰褐至黃褐；能生成褐可溶性素。

2.2生理生化特征

實驗參照徐麗華等主編的《放線菌系統學》相關方法操作。(徐麗華,李文均,劉志恒.放線菌系統學—原理、方法及實踐.北京:科學出版社,2007:40-47,66-80,119-128.)菌株CPCC204717生長溫度10-37℃，最適溫度28—30℃。明膠液化、牛奶凝固并胨化、淀粉水解以及硝酸鹽還原實驗陽性；能夠產生類黑素、酪氨酸酶。能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、果糖以及乳糖、甘露糖、纖維二糖、麥芽糖、淀粉、甘油、山梨醇、水楊苷、醋酸鈉；不能同化蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、甘露醇、松三糖、纖維素、衛矛醇、側金盞醇以及七葉樹素。

2.3序列測定及分析：提取菌株CPCC204717的基因組，PCR擴增其16S rRA基因并進行測序，結果表明菌株CPCC204717的16S rRA基因具有SEQ ID o.1的DA，與菌株Kitasatospora aburaviensis strain RCS252(GenBank Accession o.MK942686.1)的16S rRA基因相似性達99.66％。

根據菌株CPCC204717形態特征、生理生化特征和16S rRA基因序列，確定菌株CPCC204717為北里孢菌屬細菌(Kitasatospora sp.)。菌株CPCC204717已于2020年07月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC o.20381。下文簡稱北里孢菌CPCC204717。

實施例2、式I與式Ⅱ所示化合物的分離、制備及結構鑒定

1.種子液的制備

將北里孢菌CPCC204717孢子液接種于ISP4培養基平板[配方為：可溶性淀粉10g，K2HPO41g，MgSO4 1g，aCl 1g，(H4)2SO4 2g，CaCO3 2g，FeSO4 1mg，MnCl2 1mg，ZnSO4 1mg，瓊脂15g，用去離子水定容至1L，121℃滅菌15分鐘得到ISP4培養基]上，置于28℃恒溫培養箱培養7-14天，用無菌鐵鏟取約1cm2的含菌瓊脂塊接種于100mL液體TCG發酵培養基[配方為：葡萄糖4g，酪蛋白5g，胰蛋白胨3g，用去離子水定容至1L，121℃滅菌15分鐘得到液體TCG發酵培養基]，在500mL三角瓶中，28℃，200r/min，搖瓶培養3天得到種子液。

2.從液體發酵產物中制備式I與式Ⅱ所示的化合物

2.1北里孢菌CPCC204717液體發酵產物的制備

取10mL步驟1的種子液轉接于含有100mL A1培養基[配方為：黃豆粉15g，可溶性淀粉30g,K2HPO4 0.5g,FeSO4 0.5g,a2S2O3 0.007μg KCl 0.3g，用去離子水定容至1L，pH＝7.2，121℃滅菌15分鐘得到A1液體發酵培養基]的500mL錐形瓶中，共23L，28℃，200r/min震蕩培養5天；得到北里孢菌CPCC204717液體發酵產物。

2.2分離純化式I與式Ⅱ所示的化合物

將2.1的北里孢菌CPCC204717液體發酵產物離心(6000rpm，10mim)，得到上清液和菌絲體，上清液用大孔樹脂進行固相萃取，先后用水、50％丙酮與丙酮進行洗脫，分別收集餾分，得到上清液提取物，具體方法如下：離心得到的上清液按每瓶300mL分裝到500mL錐形瓶中，每瓶按10％(g/mL)的比例加入XAD7HP大孔樹脂(Rohm&Haas,Amberlite XAD7HP型大孔樹脂),置于搖床上，200rpm震蕩12小時。然后將大孔樹脂合并倒入層析柱內，先用蒸餾水洗脫，洗脫至流出液澄清，再加50％丙酮水溶液洗脫至流出液無顏，再用丙酮洗脫至流出液無顏。從50％丙酮水溶液洗脫程序開始不間斷收集50％丙酮水溶液洗脫出的液體(簡稱50％丙酮水溶液洗脫部分的上清液提取物)。從丙酮洗脫程序開始不間斷收集丙酮洗脫出的液體(簡稱丙酮洗脫部分的上清液提取物)。

離心得到的菌絲體加等體積的丙酮超聲(40kHz,3h)，得到菌絲體提取物。將50％丙酮水溶液洗脫部分的上清液提取物與丙酮洗脫部分的上清液提取物與菌絲體提取物合并，通過硅膠柱層析分離，硅膠柱層析中所用的介質為柱層析硅膠(200-300目，400g)，所用的硅膠柱的規格為60×530mm(直徑×長度)，柱體積為1300mL。硅膠柱層析中所用的洗脫程序分如下三步：1)先用100：1的二氯甲烷-甲醇溶液(由二氯甲烷和甲醇組成的液體，該液體中二氯甲烷和甲醇的體積比為100：1)洗脫2500mL；2)接著用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液(由二氯甲烷和甲醇組成的液體，該液體中二氯甲烷和甲醇的體積比為50:1)洗脫4500mL；3)接著用20：1的二氯甲烷-甲醇溶液(由二氯甲烷和甲醇組成的液體，該液體中二氯甲烷和甲醇的體積比為20：1)洗脫4500mL。從洗脫程序開始不間斷收集洗脫出的液體，每份收集500mL洗脫液，共收集23份。收集的流出液經TLC檢測、合并，得到7個餾分即餾分F1至F7。

將硅膠柱層析收集的餾分F2(第6份到第10份收集液，用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體)通過旋轉蒸發儀濃縮，將濃縮物過凝膠柱層析，流動相為二氯甲烷-甲醇溶液。凝膠柱層析中所用的分離介質是Sephadex LH-20，層析柱規格為34×1200mm(直徑×長度)，柱體積為850mL。洗脫程序如下：采用1：1的二氯甲烷-甲醇溶液(由二氯甲烷和甲醇組成的液體，該液體中二氯甲烷和甲醇的體積比為1：1)洗脫2010mL。從洗脫程序開始不間斷收集洗脫出的液體，每管收集15mL，共計134管。收集的流出液經TLC檢測、合并，得到8個餾分，即餾分F2-1至F2-8。餾分F2-4(即收集的第91管到第98管收集液)進行HPLC制備分離，以乙腈-水溶液(由乙腈和水組成的液體，該液體中乙腈和水的體積比為40:60)進行洗脫(流速4mL/min)，收集保留時間為17.5min的洗脫峰，得到式Ⅱ所示的化合物。HPLC制備分離中所用的分離介質是Capcell C18 MG-Ⅱ，填料粒徑為5μm，層析柱直徑為10mm，長為250mm。

將硅膠柱層析收集的餾分F3至F6(即第11份至第21份收集液，用50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體和用20：1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脫出的液體)合并后進行凝膠柱層析，流動相為甲醇。凝膠柱層析中所用的分離介質是Sephadex LH-20，層析柱規格為34×1200mm(直徑×長度)，柱體積為850mL。洗脫程序如下：采用甲醇洗脫2625mL(約3個柱體積)。從洗脫程序開始不間斷收集洗脫出的液體，每管收集15mL，共收集175管。流出液經TLC檢測、合并，得到8個餾分即餾分F3-1至F3-8。將收集的4個餾分F3-2至F3-5(第126管至第149管收集液)進行HPLC制備分離，以乙腈-水溶液(由乙腈和水組成的液體，該液體中乙腈和水的體積比為40:60)進行洗脫(流速4mL/min)，收集保留時間為12.3min的洗脫峰，得到式I所示的化合物，收集保留時間為17.5min的洗脫峰，得到式Ⅱ所示的化合物。HPLC制備分離中所用的分離介質是Capcell C18 MG-Ⅱ，填料的粒徑為5μm，層析柱直徑為10mm，長為250mm。

3.從固體發酵產物中制備式I與式Ⅱ所示的化合物

3.1北里孢菌CPCC204717固體發酵產物的制備

將步驟1的種子液按10％的接種量，轉接于大米固體發酵培養基[配方為：大米100g，蛋白胨0.3g，用去離子水100mL，121℃滅菌15分鐘得到大米固體發酵培養基]，共50瓶，28℃靜置培養30天，得到北里孢菌CPCC204717固體發酵產物。

3.2分離純化式I與式Ⅱ所示的化合物

收集3.1的北里孢菌CPCC204717固體發酵產物，加入乙酸乙酯超聲提取3次(10L×3)，每次60min，提取液經減壓回收溶劑后，得到乙酸乙酯提取物。

將乙酸乙酯提取物經C18反相閃式柱(520g,60mm×440mm(直徑×長度)譜分離，柱體積為730mL。該譜分離中所用的洗脫程序如下：1)采用10％的甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為10：90)洗脫3000mL；2)接著用30％的甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為30：70)洗脫2500mL；3)接著用50％的甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為50：50)洗脫2500mL；4)接著用70％的甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為70：30)洗脫3400mL。收集用70％的甲醇水溶液洗脫出的液體，將該液體命名為餾分F4。

將餾分F4經凝膠柱層析分離，流動相為80％的甲醇水溶液。凝膠柱層析中所用的分離介質是Sephadex LH-20，柱子規格為34×1200mm(直徑×長度)，柱體積為850mL。洗脫程序如下：采用80％的甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為80：20)洗脫2400mL，從洗脫程序開始不間斷收集洗脫出的液體，每管收集15mL，共收集160管。流出液經TLC檢測、合并得到12個洗脫餾分即餾分F4-1至F4-12。餾分F4-4(第80至第90管收集液)經凝膠柱層析分離，流動相為70％甲醇水溶液。凝膠柱層析中所用的分離介質是Toyopearl HW-40F，柱子規格為30×1200mm(直徑×長度)，柱體積為640mL。洗脫程序如下：采用70％甲醇水溶液(由甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為70：30)洗脫1920mL(3個柱體積)，從洗脫程序開始不間斷收集洗脫出的液體，每管收集15mL，得到128管，經TLC檢測、合并，得到11個餾分，命名為餾分F4-4-1至F4-4-11。將F4-4-3至F4-4-11的9個餾分(第75至第128管收集液)進行HPLC譜分離純化(譜柱參數為YMC-Pack Ph 5μm，10mm×250mm；流動相為60％甲醇水溶液(由譜甲醇和水組成的液體，該液體中甲醇和水的體積比為60：40)，流速4mL/min)，收集保留時間為28.0min的洗脫峰，得到式I所示的化合物，收集保留時間為36.5min的洗脫峰，得到式Ⅱ所示的化合物。

4.式I與式Ⅱ所示的化合物的結構鑒定

4.1式Ⅰ所示化合物：南平霉素D的結構鑒定

白粉末狀,易溶于甲醇、氯仿、DMSO。高分辨電子噴霧質譜(HRESIMS)顯示出準分子離子峰m/z 766.2967[M+H]+(C35H44O99S理論值為766.2977，圖1)，結合核磁共振波譜(MR)數據，確定其分子式為C35H43O99S，不飽和度為20。式I所示化合物的IR光譜(圖2)在3392、3299、1648、1539，1508cm-1顯示出特征吸收峰，提示結構中存在氨基、羰基和苯環等官能團。式I所示化合物的1H MR譜(CDCl3，圖3，表1)在低場顯示出6個芳香或烯氫質子信號δH8.10(s,H-17),6.98(d,H-22),6.42(d,H-26),7.02(t,H-27),6.78(d,H-28),5.19(q,H-8)以及7個活潑質子信號。在高場區顯示出3個雙峰甲基、2個單峰甲基、1個氮甲基、1個甲氧基信號，以及在1.54～5.50顯示出9個亞甲基和次甲基質子信號。式I所示化合物的13C MR譜(圖4)顯示出35個碳信號，DEPT譜(圖5)表明這些碳分別為16個季碳(其中1個酮羰基碳δC200.5，7個酰胺羰基碳)，9個次甲基碳[其中6個為sp2雜化碳，3個為含氮脂肪次甲基δC 52.5(C-20),48.6(C-3)和45.4(C-14)]，3個亞甲基和7個甲基碳。以上MR數據顯示出肽類化合物的典型特征，包含7個酰胺羰基碳、6個α-氨基碳和7個氨基質子。

通過2DMR譜(1H-1H COSY,HSQC,HMBC)(圖6-8)數據分析，確定式I所示化合物中存在1個甘氨酰(Gly)、2個丙氨酰(Ala)、1個2-氨基-2-丁烯酰(Dhb)、1個-甲基甘氨酰(Sar)、1個以噻唑酰(Tzl)形式出現的半胱氨酸和1個甲氧基取代的氨酰(OMeTrp)、一個α-甲基脫氫蘇氨酰(MeDht)結構單元。通過分析HMBC譜的遠程C-H相關信號，進一步確定了各氨基酸殘基及其連接方式。其中，H-1和H2-1與C-1和C-2的相關信號表明結構中存在甘氨酰單元；H-3與C-2,C-3和C-4，H-3與C-2和C-6，H3-4與C-3和C-6的相關信號，表明存在一個丙氨酰單元，與甘氨酸殘基連接；H-7與C-6、C-7和C-8,H3-9與C-8，H-8與C-10的相關信號，表明結構中存在一個2-氨基-2-丁烯酰單元，與丙氨酸殘基連接；H-12a與C-13和C-10，H3-11與C-10和C-12的相關信號，表明存在一個-甲基甘氨酰單元，與2-氨基-2-丁烯酸殘基連接；H-14與C-13、C-14，H3-15與C-14、C-16的相關表明存在丙氨酰單元，與-甲基甘氨酸殘基連接；H-17與C-16、C-18、C-19的相關，結合其化學位移表明結構中含有1,3-噻唑結構單元與丙氨酰單元連接；H-20與C-19、C-20、C-31，H2-21與C-20、C-22、C-23、C-24，H-22與C-23、C-24、C-29，H-26與C-24、C-28，H-28與C-24和C-26，H3-30與C-25的相關，表明分子中存在4-甲氧基氨酰基單元，與1,3-噻唑酰基連接。在ROESY譜(圖9)中，H-22與H-28相關，OMe-30與H-26相關，進一步確證甲氧基連接在氨酸的4位(C-25)。H-32與C-31、C-32、C-34、C-36，H3-33與C-32、C-34、C-36，H3-35與C-34的相關，表明存在2-甲基脫氫蘇氨酰單元，與氨酰殘基連接。最后，H-1和H2-1與C-36的相關信號，表明2-甲基脫氫蘇氨酰與甘氨酰殘基連接。H3-9與H-7的ROESY相關峰，表明C-7與C-8的雙鍵構型為Z構型。因而確定了南平霉素D的平面結構為環[甘氨酰-丙氨酰-(2-氨基-2-丁烯酰)-(-甲基甘氨酰)-丙氨酰-1,3-噻唑酰-4-甲氧基氨酰-(2-甲基脫氫蘇氨酰)]。

式I所示化合物的絕對構型利用高級Marfey’s方法以及量子化學MR計算的方法確定。L-丙氨酸標準品的L和D-FDLA衍生物(m/z 384)的保留時間分別為28.2和34.3min。式I化合物酸水解產物中丙氨酸的L、D-FDLA衍生物(m/z 384)峰保留時間分別為34.2和28.2min，與標準品保留時間順序相反。因此，結構中的丙氨酰單元確定為D型。L-4-甲氧基氨酸標準品的L-和D-FDLA衍生物(m/z 529)保留時間分別為39.2和45.4min，式I化合物水解產物的4-甲氧基氨酸的L、D-FDLA衍生物(m/z 592)峰保留時間分別為39.1和45.4min，與標準品保留時間一致。因此結構中的4-甲氧基氨酸殘基確定為L型。為確定丙氨酰-1,3-噻唑酰結構單元(Ala-Tzl)中丙氨酰的絕對構型，先將式I所示化合物進行臭氧氧化以釋放出丙氨酰單元，然后將臭氧化產物經酸水解后，分別與L、D-FDLA進行衍生化反應。式I化合物臭氧化產物的L/D-FDLA-Ala衍生物m/z 384峰保留時間分別為34.2和28.2min，與L-丙氨酸標準品衍生物保留時間順序相反。因此式I所示丙氨酰-1,3-噻唑酰結構單元中的丙氨酰結構單元確定為D型。

在化合物南平霉素D中，由于除α-甲基脫氫蘇氨酰(α-Me-Dht)外的手性氨基酸的構型，如D-Ala、D-Ala-Tzl和L-4-OMe-Trp均已確定，因此該化合物的絕對構型僅存在兩種可能，即3R,14R,20S,32S(異構體A)和3R,14R,20S,32R(異構體B)。為確定其絕對構型，對這兩種異構體進行量子化學MR計算(Willoughby,P.H.et al.at.Protoc.2014,9,643-660.)。利用校正平均誤差(corrected mean absolute error,CMAE)對兩種異構體MR化學位移計算值和實驗值進行比較分析，結果顯示具有3R,14R,20S,32S構型的異體體A的13C和1H的校正平均誤差值均小于具有3R,14R,20S,32R構型的異構體B(表2)。進一步利用DP4+方法(Grimblat,.et al.J.Org.Chem.2015,80,12526-12534.)對計算值進行分析，結果顯示，基于13C和1H數據計算，異構體A的可能性為100％(表3)。因此，南平霉素D的絕對構型確定為3R,14R,20S,32S。

表1.南平霉素D與澤爾科瓦霉素的1H和13C MR數據(CDCl3)

表2南平霉素D兩種異構體的MR計算數據

a表示校正平均絕對誤差，b表示最大絕對誤差。

表3南平霉素D兩種異構體的DP4+分析

式I所示化合物(南平霉素D，nanpingmycin D)的理化數據：白粉末狀。[α]20D+86.5(c 1.00,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)222(4.78),282(3.69)nm；ECD(c 1.63×10-4M)λmax(Δε)205(+82.72),252(-8.89)nm；IR vmax:3392,3299,2921,2850,1648,1539,1508,1469,1254,1206,970,738cm-1；1H-MR(CDCl3,600MHz)數據見表1,13C MR(CDCl3,150MHz)數據見表1；HRESMS:m/z 766.2967[M+H]+(C35H449O9S理論值為766.2977)。式I所示化合物的結構式如下：

4.2式Ⅱ所示化合物：澤爾科瓦霉素(zelkovamycin)的結構鑒定

白粉末狀,易溶于甲醇、氯仿、DMSO。高分辨電子噴霧質譜(HRESIMS)顯示出準分子離子峰m/z 780.3142[M+H]+(C36H46O99S計算值780.3134，圖10)，結合MR數據確定其分子式為C36H45O99S。式Ⅱ所示化合物在CDCl3中測得的C譜和H譜(圖11-12)數據與文獻報道的zelkovamycin化合物一致，確定式II所示化合物與zelkovamycin實際上是同一個化合物。然而文獻中zelkovamycin結構中的甲氧基取代在氨酸的C-7位(即C-28)，而式I化合物中甲氧基確定取代在中氨酰單元的C-4位(即C-25)。從化合物的生源途徑上考慮，式II所示化合物應當具有相同的氨酸取代形式。在ROESY譜(圖13)中，也觀察到H-22與H-28以及甲氧基質子與H-26的相關信號，證實了在化合物Ⅱ中甲氧基同樣取代在氨酸單元的C-4位，即C-25位。因此，將zelkovamyicn的平面結構修訂為環[甘氨酰-(2-氨基)丁酰-(2-氨基-2-)丁烯酰-(-甲基)甘氨酰-丙氨酰-1,3-噻唑酰-(4-甲氧基)氨酰-(2-甲基)脫氫蘇氨酰]。

式Ⅱ所示化合物的絕對構型利用高級Marfey’s反應以及量子化學MR計算的方法確定。式Ⅱ化合物中，4-甲氧基氨酰L-、D-FDLA衍生物(m/z 529)分別與L-4-甲氧基氨酸標準品保留時間一致；2-氨基丁酰基L、D-FDLA衍生物(m/z 398)分別與L-2-氨基丁酸標準品的FDLA衍生物保留時間順序相反。因此確定，4-甲氧基氨酰和2-氨基丁酰單元分別為L和D構型。此外，將式Ⅱ化合物進行臭氧氧化然后進行酸水解、Marfey反應，確定丙氨酰-噻唑酰(Ala2-Tzl)中丙氨酰構型為D構型。從生源途徑上考慮，式Ⅱ化合物與式I化合物中具有相同的甲基脫氫蘇氨酸，因此推測二者具有相同的立體構型，因此式II化合物中C-32構型也確定為32S。據此，式Ⅱ所示化合物的絕對構型確定為3R,14R,20S,32S。

式II所示化合物(澤爾科瓦霉素，zelkovamycin)的理化數據：白粉末狀,易溶于甲醇、氯仿、DMSO。[α]20D+86.0(c 1.00,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)220(4.68),283(3.63)nm；ECD(c 1.60×10-4M)λmax(Δε)205(+59.49),249(-5.82)nm；1H-MR(CDCl3,600MHz)數據見表3,13C MR(CDCl3,150MHz)數據見表3；HRESMS:m/z 780.3142[M+H]+(C36H469O9S理論值為780.3134)。式II所示化合物的結構式如下：

實施例3、南平霉素D(nanpingmycin D)與澤爾科瓦霉素(zelkovamycin)的抗病毒活性試驗

1.抗H11甲型流感病毒實驗方法

下述A/WS/33(H11)重組流感病毒和293T-Gluc細胞(張永欣,等.中國醫藥生物技術,2017,12(3),207-214),公眾可從申請人獲得該生物材料，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

精確稱取式I-Ⅱ所示化合物以及陽性對照藥物利巴韋林，溶于DMSO中，配置成濃度為20mM的母液供活性測試用。

本實驗以293T-Gluc細胞為病毒宿主，測定樣品抑制病毒攜帶報告基因熒光素酶活性，計算到EC50和CC50。

EC50的測試方法：將293T-Gluc細胞以2.0×105個/mL濃度接種于96孔板中，每孔100μL(于100μL含10％FBS的DMEM培養液中培養)。5％CO2，37℃培養24h后，每孔加入1μL梯度稀釋的待測化合物溶液，式I所示化合物在培養體系中的含量分別為10、2、0.5、0.1、0.05、0.02μM，式II所示化合物在培養體系中的含量分別為150、100、50、20、10、5μM，陽物在培養體系中的含量分別為80、50、40、20、10μM，同時設置空白對照(只加100μL DMEM培養基)和陰性對照(加入1μL DMSO)。孵育2h后利用A/WS/33(H11)重組流感病毒感染細胞(MOI＝0.3)，繼續培養24h后，每孔取10μL上清，于多功能酶標儀(Berthold Centro LB960)測定熒光素酶活性，計算各樣品的抑制率并計算EC50(將病毒抑制50％所需的濃度)，實驗重復三個復孔。其中，A/WS/33(H11)重組流感病毒的制備方法如下：在10cm細胞培養皿中以3:1比例接種1.8×106個293T細胞和0.6×106個MDCK細胞。培養24h后，轉染甲型流感病毒(IAV)A/WS/33(H11)的8質粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-P，pHW186-A，pHW187-M，pHW188-S)，轉染量為1.2μg，轉染試劑為Lipofectamine2000，根據使用說明書，每皿使用40μl。轉染6h后，更換為新鮮DMEM培養基。轉染24h后加入終濃度為1μg/mL的TPCK-trypsin。48h后收上清，1000rpm離心5min去掉細胞碎片，用0.45μm濾膜過濾，分裝成小份，得到A/WS/33(H11)重組流感病毒，保存于-80℃冰箱。其中，甲型流感病毒(IAV)8質粒反向遺傳系統獲贈于Dr.Robert G.Webster，分別為：pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-P，pHW186-A，pHW187-M，pHW188-S(Hoffmann,E.,G.eumann,et al.A DA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids[J].Proc atl AcadSci U SA,2000,97:6108-6113)。

CC50的測定：293T-Gluc細胞細胞接種于96孔板，每孔2.0×104個細胞，于100μL含10％FBS的DMEM培養液中培養。細胞鋪板24h后每孔加入1μL梯度稀釋的待測化合物溶液，使待測化合物(式I所示化合物、式II所示化合物或利巴韋林)在培養體系中的含量分別為式I所示化合物在培養體系中的含量分別為10、2、0.5、0.1、0.05、0.02μM，式II所示化合物在培養體系中的含量分別為150、100、50、20、10、5μM，利巴韋林在培養體系中的含量分別為80、50、40、20、10μM，同時設置空白對照(只加100μL DMEM培養基)和陰性對照(加入1μL DMSO)，37℃孵育48h。取出96孔板，每孔加入10μL CCK-8，37℃繼續孵育1-2h后，使用多功能酶標儀(Berthold Centro LB 960)檢測各孔在450nm波長處的光吸收值，用以計算半數細胞毒性濃度CC50(致使50％細胞死亡的藥物濃度)。實驗重復三次。

2.抗丙型肝炎細胞(HCV)實驗方法

下述丙型肝炎病毒J6/JFH(Peng,Z.-G..et al.Hepatology 2010,52,845-853),公眾可從申請人獲得該生物材料，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

精確稱取式I-Ⅱ所示化合物，溶于DMSO中，配置成濃度為50mM的母液供活性測試用，陽物索非布韋配置成濃度為20mM的母液供活性測試用。

人肝癌細胞系Huh7.5細胞以3×104個/cm2的密度接種到96孔板中，每孔100μL(于100μL含10％FBS的DMEM培養液中培養)5％CO2，37℃培養24h后，待細胞貼壁后，用丙型肝炎病毒J6/JFH上清液以MOI＝0.1病毒感染量感染正常Huh7.5細胞，同時加入相應藥物或陽溶液，使藥物(式I所示化合物或式II所示化合物)在培養體系中的含量分別為500、100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064μM，索非布韋在培養體系中的含量分別為200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128、0.00256μM，同時設置空白對照(只加等體積的培養基)和陰性對照(加入等體積的DMSO)。繼續培養72小時后，吸棄培養上清,細胞用PBS漂洗一次，加入固定液，室溫固定20分鐘，吸棄固定液，加入0.3％Triton-100穿孔20分鐘，加入封閉液室溫封閉1小時,加入50μL用封閉液稀釋的一抗(HCV Core和GAPDH)(HCV Core，丙型肝炎核心蛋白小鼠單克隆抗體，貨號ab2740，購自英國Abcam公司。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶兔單克隆抗體，貨號10494-1-AP，購自Proteintech公司)，4℃孵育過夜，TBST漂洗四次，加入50μL抗體稀釋液稀釋的二抗(IRDye 680標記的山羊抗小鼠二抗，貨號LI-COR Cat.